目的探讨TGF-β3、透明质酸(hyaluronic acid,HA)、甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormonerelated protein,PTHrP)对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)成软骨分化的影响,优化培养条件的组合方式。方法体外分离培养人脐带间充质干细胞,形态学观察,流式检测表面抗体及成脂、成骨分化鉴定。取P3代细胞,加入不同组合的细胞因子进行成软骨诱导培养,分为1~21 d TGF-β3(G1)、1~28 d TGF-β3(G2)、1~21 d TGF-β3/1~21 d HA(G3)、1~28 d TGF-β3/1~28 d HA(G4)、1~21 d TGF-β3/1~21 d HA、14~21 d PTHrP(G5)、1~28 d TGF-β3、1~28 d HA、14~28 d PTHrP(G6)、1~28 d TGF-β3、1~28 d HA、21~28 d PTHrP(G7) 7组。结果诱导培养28 d和21 d相比较,TGF-β3组和TGFβ3/HA组COL2α1、COL10α1、SOX9、ACAN的表达量上升;TGFβ3/HA/PTHrP组COL2α1、SOX9、ACAN的表达量上升,COL10α1下降。培养相同天数时,TGFβ3/HA组较TGF-β3组COL2α1、SOX9、ACAN的表达量上升;TGFβ3/HA/PTHrP组同TGF-β3/HA组比较,COL2α1、ACAN、SOX9的表达量增加,COL10α1表达量下降,且PTHrP加入2周较1周效果更明显。差异均有统计学意义。HE和阿利新蓝染色结果与实时荧光定量PCR的结果一致。结论 TGF-β3、HA、PTHrP可以不同程度的促软骨分化,其中联合应用TGF-β3,HA 28 d,在第14天时加入PTHrP一起培养,这种组合方式促进HUC-MSCs成软骨分化效果最好,且能抑制细胞肥大。
目的采用CRISPR/Cas9系统敲除肝癌细胞系HepG2的高迁移率蛋白A2(HMGA2)基因,探讨HMGA2敲除对于肝癌细胞生长、增殖、迁移以及侵袭的影响。方法根据GenBank数据库搜索人HMGA2序列,利用在线sgRNA设计软件针对HMGA2的第一外显子以及第二外显子各设计一条sgRNA,构建靶向HMGA2的sgRNA重组敲除载体sgE1和sgE2,将sgRNA载体转染细胞,通过有限稀释法筛选得到HMGA2^-/-细胞株。通过CCK8实验以及平板克隆形成实验检测HMGA2敲除对于HepG2细胞生长以及克隆形成能力的影响;采用Transwell实验检测HMGA2敲除对于HepG2细胞迁移与侵袭的影响。结果相比于野生型,HMGA2^-/-细胞株的生长速率减慢,克隆形成能力(121.83±21.68 vs 59.50±20.68,P<0.01)、迁移(359.67±32.53 vs 245.61±24.23,P<0.05)与侵袭(251.33±43.43 vs 47.00±10.00,P<0.01)能力显著下降。结论HMGA2敲除降低了肝癌细胞HepG2的体外生存能力以及转移能力,HMGA2基因可以作为一个肝癌治疗的潜在靶点。
