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小干扰RNA干扰大鼠神经元Nogo受体mRNA表达的实验研究被引量：3: 2007年; 目的观察大鼠Nogo受体(NgR)特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在原代神经元干扰其mRNA表达的效果。方法体外培养大鼠原代皮层和海马细胞,应用阳离子脂质体转染试剂转染4对化学合成的大鼠NgR特异性siRNA,72h后提取细胞总RNA,实时荧光定量RT-PCR检测NgR mRNA表达情况。结果4对siRNA均能够下调靶基因NgR的mRNA表达水平,siNgR199、siNgR562、siNgR772和siNgR964等干扰后,NgR mRNA的表达分别为对照siRNA干扰组的6.5%、62.4%、15.2%和6.86%,与对照siRNA干扰组比较有统计学意义(P<0.05)。结论化学合成的NgR特异性siRNA能够有效的干扰大鼠原代皮层和海马细胞内NgR基因mRNA的表达水平。; 张涛吕碧涛徐盛明徐建广袁文; 关键词：生长抑制物髓磷脂蛋白质类细胞表面受体

siRNA干扰大鼠神经元Nogo受体mRNA表达的时程研究被引量：20: 2005年; 目的:观察大鼠Nogo受体(NgR)特异性小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)在原代神经元干扰其mRNA表达的时程效果。方法:体外培养大鼠原代皮层和海马细胞,应用阳离子脂质体转染试剂转染针对2个基因片段(199和964位点)的大鼠NgR特异性siRNA和对照siRNA,分别于转染后24h、48h、72h和96h,应用实时荧光定量PCR检测NgRmRNA表达情况。结果:2对siRNA(siNgR199和siNgR964)均能够下调靶基因mRNA的表达水平,24h、48h、72h和96h,NgRmRNA表达分别为对照siRNA组的38.12%、12.47%、3.96%、18.4%(siNgR199)和49.54%、24.25%、13.17%、37.93%(siNgR964),与对照siRNA组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:NgR特异性siRNA能够在原代皮层和海马细胞下调靶基因mRNA的表达水平,且基因沉默效果在转染后3d最显著。; 张涛袁文刘百峰曹莉肖林陈公星; 关键词：NOGO受体基因沉默实时荧光定量PCR

NgR特异性siRNA筛选及其表达载体构建被引量：2: 2006年; 目的:将siRNA技术应用于NgR,筛选出高效的NgR(Nogo受体)特异性siRNA,并构建其表达载体。方法:2005-03/2006-03,在杭州新瑞佳生物制药有限公司、解放军第二军医大学神经生物教研室设计筛选NgR特异性siRNA,按照E1bashir等设计原则和siRNA的要求,设计、合成4对siRNA,转染体外培养大鼠原代皮层和海马细胞,筛选出基因高沉默效率的NgR特异性siRNA;2004-03/2005-03上海生工生物工程公司将获得的高沉默效率siRNA设计成带有BamHI、HindⅢ酶切粘性末端、终止识别序列和LOOP环的发卡式RNA,并将其克隆入载体pRNAT-U6.1/Neo,构建NgR特异性siRNA表达载体,然后进行酶切鉴定及基因测序。结果:①4对NgR特异siRNA中,siRNA199下调NgRmRNA的表达水平效率最高,转染72h效果最显著(96.04%)。NgR特异性siRNA199序列为:5’-CCGAAUCUCUUACGUGCCATT-3’。②将该序列的发卡式RNA成功克隆入载体pRNAT-U6.1/Neo,构建成NgR特异性siR-NA199表达载体,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。结论:NgR特异性siRNA199及其表达载体构建成功,为进一步合成病毒载体及观察NgR特异性RNA干扰抑制大鼠NgRmRNA表达对脊髓损伤的修复作用奠定了基础。; 刘百峰张涛袁文吕碧涛徐盛明何成; 关键词：质粒脊髓损伤

大鼠Nogo受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定被引量：2: 2007年; 目的:构建大鼠Nogo受体(Nogoreceptor,NgR)基因RNA干扰慢病毒表达载体,并观察其对293T细胞感染效率。方法:应用基因工程技术,首先构建携带目的基因siNgR199的慢病毒穿梭质粒表达载体,然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染48h后收集上清离心过滤后冰浴保存,最后进行病毒滴度测定,与标准病毒液分别感染293T细胞,按MOI值分为5个梯度:1、3、5、10、20,以确定病毒滴度及适合感染的MOI值。其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果:酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1×108ifu/m1,适合感染的MOI值为3。结论:应用基因工程技术,成功构建了大鼠siNgR199慢病毒表达载体,为应用于治疗脊髓损伤后轴突再生创造了条件。; 吕碧涛袁文徐盛明刘百峰曹莉; 关键词：慢病毒 NOGO受体 RNA干扰

慢病毒介导RNA干扰Nogo受体基因治疗脊髓损伤的实验研究被引量：5: 2010年; 目的观察慢病毒介导RNA干扰大鼠神经元Nogo受体（NgR）基因表达对脊髓损伤的修复作用。方法将前期实验中构建好的针对NgR的特异性小干扰RNA系列siNgR199慢病毒重组体，按感染复数=3体外转染已培养好的大鼠皮层神经元细胞。荧光电镜观察慢病毒重组体的转染效率，采用实时荧光定量PCR检测NgR基因沉默效率，验证慢病毒重组体的有效性。建立大鼠重度脊髓损伤模型，大鼠分组后分别于大脑皮层运动区注射生理盐水、慢病毒重组体，采用BBB评分法观测大鼠后肢运动恢复情况，采用神经示踪法观察脊髓损伤区神经纤维生长情况。结果慢病毒重组体体外转染神经元细胞的效率〉99％，NgR基因沉默效率为61％。大鼠模型给药后8周，慢病毒重组体组大鼠脊髓损伤区可观察到神经纤维生长通过，而生理盐水组大鼠脊髓损伤区未见神经纤维生长通过，BBB评分结果提示慢病毒重组体组大鼠后肢运动功能恢复优于生理盐水组（P〈0．01）。结论慢病毒siNgR199重组体能够促进脊髓损伤区神经纤维的生长，在一定程度上促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复。; 吕碧涛袁文徐盛明; 关键词：慢病毒属 RNA干扰脊髓损伤 NOGO受体

中枢神经系统应用病毒载体介导RNAi基因治疗: 2006年; 近几年在基因治疗的临床试验方面发生了几起病例死亡事件，对基因治疗临床试验的开展产生了巨大的负面影响。有关部门对基因治疗临床试验制定了更为严格的规定，但是一些接受基因治疗试验的患者的良好治疗效果进一步证实了基因治疗的可行性。这些信息告诉我们应该清楚地认识病毒载体和转基因技术对宿主细胞可能产生的多种不同影响。现已证实在转基因治疗中病毒有可能激活插入点附近的原癌基因，因此发现一种不整合人宿主基因或精确定点整合宿主基因的病毒载体显得尤为重要。; 吕碧涛刘百峰袁文; 关键词：基因疗法 RNA干扰原癌基因

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