黑龙江省科技攻关计划(2006G0461-00)
- 作品数：22 被引量：119H指数：8
- 相关作者：李德山任桂萍王文飞刘铭瑶李晋南更多>>
- 相关机构：东北农业大学哈尔滨医科大学新乡学院更多>>
- 发文基金：黑龙江省科技攻关计划哈尔滨市科技创新人才研究专项资金黑龙江省教育厅资助项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 高效可溶性重组蛋白表达载体的构建被引量：9
- 2010年
- 本研究构建了两种高效表达可溶性重组蛋白的原核表达载体。一种载体由HisSUMO序列与pET30a(+)载体连接而成(命名为HisSUMO Express),表达的融合蛋白用Ni-NTA纯化,用SUMO蛋白酶I切割后可获得不留任何残基的重组蛋白。SUMO-蛋白酶I价格较贵,为减少表达蛋白的成本,第二种载体即在His-SUMO和目的序列之间加入羟胺切割位点(命名为HisSUMO Economic)。在HisSUMO Economic中表达的融合蛋白用Ni-NTA纯化,羟胺液切割后可获得仅留一个甘氨酸残基的重组蛋白。以在常规表达载体中难以表达的鼠源成纤维细胞生长因子-21(mFGF-21)为例,经葡萄糖消耗实验检测其活性,验证两种表达载体的效果。结果表明mFGF-21在两种载体中均获得了高效表达,融合蛋白占菌体总蛋白的40%以上,Ni-NTA纯化后的融合蛋白分别利用羟胺切割液和SUMO蛋白酶I切割,纯化的mFGF-21成熟蛋白回收量约为54mg/L,回收率约为6%。经两种载体表达后的mFGF-21蛋白均具有生物学活性,可促进脂肪细胞消耗葡萄糖,为进一步研究提供了基础。
- 姜媛媛刘铭瑶任桂萍朱慧萌李德山
- 关键词：高效表达载体
- FGF-21通过上调肝脏LDL受体的表达降低血浆中LDL水平被引量：3
- 2010年
- 目的成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)可降低实验动物血浆中的低密度脂蛋白(LDL)的浓度,但其作用机制尚不清楚,本实验试图通过研究FGF-21对LDLR的调节作用揭示FGF-21调节血浆LDL浓度的机制。方法向谷氨酸钠(MSG)肥胖大鼠连续注射FGF-21蛋白40d后,检测其血浆中LDL的变化,并用荧光定量PCR的方法结合免疫荧光检测FGF-21对肝脏组织中LDLR mRNA及蛋白的影响。结果 MSG肥胖鼠经FGF-21处理,血浆内的LDL降低18%,其肝脏组织中LDLR mRNA含量提高9倍;HepG2细胞内的LDLR mRNA表达量随FGF-21处理时间增加而提高,且呈剂量依赖性;流式细胞仪检测显示,经FGF-21处理后HepG2细胞表面LDLR蛋白数量增加。结论 FGF-21通过增加肝细胞的LDLR表达量从而降低血浆中LDL浓度。
- 于艺雪任桂萍王文飞王菁孙国鹏张巧刘铭瑶李德山
- 关键词：低密度脂蛋白低密度脂蛋白受体HEPG2细胞
- 不同活动、饥饿和饮食成分状态下FGF21的动力学表达被引量：1
- 2012年
- 成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor,FGF21)是FGF家族中的新成员.目前研究显示,FGF21是一个新的糖脂代谢调节因子,有望成为治疗糖尿病的新型药物.为探讨FGF21的生理功能,利用real-time PCR和Western印迹,检测FGF21在不同生理或病理状态下基因水平和蛋白水平的表达量变化规律.实验结果显示,在全天24 h中,小鼠肝脏中FGF21在晚18点至21点,表达量显著升高,这可能与啮齿类动物傍晚活动加强及进食习性有关;FGF21在饥饿后表达量显著升高,在饥饿后喂食FGF21的表达量下降,并且随着饥饿时间的延长,FGF21的表达量升高,说明FGF21与饥饿程度呈正相关;灌注葡萄糖后20 min内,FGF21的表达量下降,而灌注脂肪乳20 min内,FGF21的表达量上升,说明葡萄糖是FGF21的负调节因子,而脂肪乳是FGF21的正调节因子;利用谷氨酸钠造模的肥胖小鼠,肝脏中FGF21的表达量显著高于同龄对照组,说明肥胖可诱导FGF21高表达.综上所述,FGF21的表达量变化与小鼠夜间活动取食、饥饿程度、饮食中不同的成分以及肥胖有关.
- 李晋南张振宇王文飞陈睿赵景壮任桂萍李德山
- 关键词：成纤维细胞生长因子21REAL-TIMEPCR
- 应用流式细胞仪分选中性粒细胞的研究被引量：9
- 2009年
- 以外周血为样本,应用FACS Aria流式细胞仪分选中性粒细胞,摸索分选最佳条件。采用分选质控试剂Accudrop Beads和鞘液为材料,在FACS Aria流式细胞仪上,对分选液滴的振荡频率(Freq)、振动幅度(Ampl)和液滴间隔值(Gap)进行调试,摸索分选的最佳设定值。结果表明,喷嘴使用70mm,主液流窗Ampl值设定为5.5,Drop1值为197,Gap值为8,侧液流断点窗液滴延迟值为45.31,2nd值为15,3rd值为7,从白细胞中分选中性粒细胞,纯度可达99%。
- 李璐刘向宇李德山
- 关键词：流式细胞仪分选中性粒细胞
- SUMO融合系统高效表达可溶性鼠源FGF-21及其活性的研究被引量：7
- 2009年
- 利用SUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达鼠源成纤维细胞生长因子(FGF-21)成熟蛋白,并研究其调节血糖的功能。将鼠源FGF-21成熟蛋白基因亚克隆至SUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。将3T3-L1成纤维细胞分化成脂肪细胞,经微量化的GOD-POD法检测培养基中葡萄糖含量,统计学分析葡萄糖消耗率。结果表明,在SUMO表达体系中鼠源FGF-21成熟蛋白基因以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效地切割,获得纯度较高的成熟蛋白。与未经处理的脂肪细胞对照组相比,经鼠源FGF-21成熟蛋白处理后脂肪细胞对葡萄糖的摄取利用显著增加,残存在培养基中的葡萄糖含量明显减少;两样本比较的t检验,P<0.001,差异极显著。
- 任桂萍姜媛媛刘铭瑶孙国鹏叶贤龙李德山
- 关键词：SUMO分子伴侣葡萄糖吸收
- 筛选糖尿病候选药物FGF-21受体激动剂的新型细胞模型的建立被引量：3
- 2011年
- 建立以成纤维细胞生长因子-21(fibroblast growth factor-21,FGF-21)信号通路为靶点的药物筛选细胞模型,用于筛选FGF-21受体激动剂类的新型治疗糖尿病药物。FGF-21的生理功能主要是通过细胞表面的FGFR及辅助受体βklotho传递信号,从而激活细胞内相关调控的一系列信号通路以及基因转录来实现的。本实验将βklotho基因构建到逆转录病毒表达载体pBMN-IRES-EGFP。将该载体导入包装细胞,收集病毒上清液并感染3T3-L1细胞,筛选到稳定表达βklotho细胞系。该细胞模型在FGF-21作用下可以促进细胞葡萄糖转运蛋白-1表达及转运水平升高,从而提高细胞糖吸收能力。构建该细胞系可以方便对FGF-21及类似药物进行高通量筛选,为糖尿病药物的研究提供了一种新方法。
- 高红梅王文飞张巧韩阳王琪任桂萍付云威李德山
- 关键词：FGF-21药物筛选糖尿病药物
- FGF21-L-Fc融合蛋白表达及其降糖作用初步评价被引量：4
- 2011年
- 成纤维细胞生长因子-21(FGF21)是FGF家族成员之一,最近发现具有独立调节血糖的作用。为了提高FGF21稳定性来达到更好的药效,通过柔性接头连接,制备重组融合蛋白FGF21-L-Fc,并对其生物学活性和体内药效学进行初步研究。纯化后的FGF21-L-Fc融合蛋白经鉴定,其分子量和特异性均与理论值相符。经微量化的GOD-POD法检测表明,FGF21-L-Fc融合蛋白能刺激体外培养的已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖吸收,其葡萄糖消耗率与野生型相比有很大提高;在STZ造模糖尿病小鼠体内,其药效比野生型持续时间长。结果表明,改造的蛋白比野生型药效更持久,为以后FGF21的临床应用奠定了基础。
- 姚文兵任桂萍韩阳曹宏伟高红梅阚方明王琪李德山
- 关键词：葡萄糖吸收稳定性
- FGF受体-1和FGF受体-2介导成纤维细胞生长因子-21信号传导被引量：3
- 2010年
- 成纤维细胞生长因子-21是FGF家族成员,FGF-21与其他FGF家族成员不同,它没有促进细胞分裂的作用,但具有很强的调节血糖作用.本实验旨在系统研究FGF-21的功能受体,以及配体/受体的作用机制,为深入研究FGF-21的生物功能,加快FGF-21从基因到药物的转变奠定理论基础.前期实验表明,FGF-21促进3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢,对前脂肪细胞无作用,说明3T3-L1脂肪细胞表达FGF-21功能受体.本文以3T3-L1脂肪细胞为靶标,深入研究FGF-21的功能受体.在FGF-21作用下3T3-L1脂肪细胞中的FGF受体1(R1)和FGF受体2(R2)形成特异性异源二聚体.脂肪细胞经FGF-21处理后,R1和R2均迅速发生磷酸化,表明两个受体均被FGF-21激活.siRNA干涉实验表明,抑制R1和R2功能可以抑制FGF-21处理后3T3-L1脂肪细胞Glut1的表达水平,揭示了FGF-21通过R1和R2上调3T3-L1脂肪细胞中Glut1的表达.免疫印迹结果表明,FGF-21可以介导3T3-L1脂肪细胞表面R1和R2的内吞.克隆后测序分析结果表明,3T3-L1脂肪细胞表达的FGF受体为FGFR-1Ⅲc和FGFR-2Ⅲc.结果表明,FGFR-1Ⅲc和FGFR-2Ⅲc是FGF-21的功能受体,参与FGF-21在脂肪细胞中介导的糖代谢活性的信号传导.
- 任桂萍尹杰超王文飞李璐李德山
- 关键词：FGF-21葡萄糖代谢GLUT1
- 成纤维细胞生长因子(FGF)-21改善胰岛素抵抗肝细胞对葡萄糖的吸收和肝糖原的合成被引量：21
- 2009年
- 在体外建立胰岛素抵抗肝细胞模型,探讨在胰岛素抵抗状态下成纤维细胞生长因子(FGF)-21对模型细胞糖代谢的影响及机制.将HepG2细胞置于10-7mol/L的胰岛素培养基中培养24h,建立胰岛素抵抗细胞模型.分别用不同浓度的胰岛素和FGF-21处理模型细胞,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测细胞对葡萄糖的摄取情况,并检查胰岛素与FGF-21的协同作用.利用实时荧光定量PCR检测FGF-21对模型细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)mRNA表达的影响,蒽酮法检测模型细胞糖原合成量,探讨FGF-21对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖摄取的影响及机制.结果发现,用高浓度胰岛素处理HepG2细胞24h后,细胞对胰岛素的敏感性显著降低,说明成功建立了胰岛素抵抗细胞模型,抵抗状态可维持48h,未发现细胞形态学变化.FGF-21能改善胰岛素抵抗模型细胞的葡萄糖摄取,参与肝糖原的合成,并与胰岛素产生协同作用.实时荧光定量PCR结果发现,FGF-21作用模型细胞后,细胞的GLUT1mRNA表达量显著增加,说明FGF-21促进模型细胞摄取葡萄糖的作用机制与其增加GLUT1的表达有关.
- 刘铭瑶王文飞于艺雪侯玉婷任桂萍李德山
- 关键词：胰岛素抵抗HEPG2FGF-21
- 模拟1型糖尿病发病过程的迟发性动物模型建立
- 2010年
- 孙国鹏任桂萍叶贤龙张振宇李德山
- 关键词：链脲佐菌素尾静脉注射糖尿病动物模型
