本实验采用扫描电子显微镜、X射线衍射、拉曼、红外等现代光谱技术和数据库、计算软件等,层层剖析猪心肌高铁肌红蛋白(pig metmyoglobin,p Met Mb)冻干粉的结构特征和分子动态结构信息。结果表明,p Met Mb冻干粉表观呈明显的棱状结晶体,结晶度为(95.60±1.37)%,三晶胞轴长不相等(a≠b≠c),可归属于高晶度含水单斜结晶体。根据晶体数据库同类化合物比对,得到p Met Mb肽链和heme-Fe的关键基团来源;经拉曼和红外光谱解析和推算,p Met Mb肽链均有α螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲4种蛋白质二级结构,分别占50%、14%、24%和12%;分别由3个酰胺区中C=O、C=C、C—N、—COO-、C—H、N—H的不同振动形式所产生;六配位低自旋的Fe—C—N形成heme-Fe3+。因此,p Met Mb为六配位低自旋构象,是结构紧密、性质稳定的球状蛋白质。
以NADH为反应体系的启动剂,研究猪心肌提取液中高铁肌红蛋白还原酶(MetMbase)活性的表达,实验结果证实酶活性的表达依赖NADH启动,且0.2 mM NADH浓度可充分启动MetMbase活性的表达.研究还表明,ATP可全程抑制MetMbase呼吸链电子的传递,抑制酶的活性;NaN3通过阻断呼吸链第三位点电子传递来抑制酶活性的表达;而N-Ethylmaleimide能与MetMbase官能团巯基(-SH)瞬间结合并快速使酶活性丧失;二价金属离子能干扰活性的表达,Zn2+可促进MetMbase活性的表达;而Cu2+和Mg2+均抑制酶活性的表达,且Mg2+抑制强度大于Cu2+.金属螯合剂EDTA可掩蔽自由金属离子对MetMbase酶促反应的干扰,改善酶活性的表达.
