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1猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及其重组伪狂犬病毒中间转移质粒的构建: 猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)是近年来兽医界广泛关注的新发现的病毒之一。该病毒基因组为环状单链DNA,大小约为1.7kb,病毒粒子无囊膜,呈二十面体对称,直径约为17nm。1995年,国际病毒...; 琚春梅陈焕春郗鑫刘正飞曹胜波; 文献传递

猪白细胞介素-2在甲醇酵母中的表达被引量：16: 2004年; 将猪白细胞介素-2(pIL-2)的完整cDNA序列克隆到甲醇酵母(Pichiapastoris)表达载体pPIC3 5K中,在E.coli体系中鉴定得到阳性克隆子pPIC3 5K-IL2。将pPIC3 5K-IL2经SacI线性化后,转化入经LiC1致敏的P.PastorisGS115菌株中,得到的重组菌株经1%浓度甲醇诱导后,利用SDS-PAGE电泳,斑点杂交及去糖基化酶消化证实,在培养上清中获得了分泌型表达的猪白细胞介素-2(蛋白分子量约为20KD),其表达量可达到80mg/L。用CTLL-2细胞进行活性检测,生物学活性可达2×106IU/ml。对其表达情况进行时间梯度分析,确定第5天表达量达到最高点,为最佳诱导时间;分析连续4个批次的重组菌株表达情况,结果表明重组菌株在适当菌体浓度下连续培养均能稳定、高效的表达外源蛋白pIL-2。本实验为进一步大规模生产pIL-2提供了理论依据。; 严琳陈焕春覃雅丽何启盖肖少波; 关键词：白细胞介素-2 甲醇酵母基因表达

表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定被引量：9: 2006年; 目的以伪狂犬病病毒为载体,构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒,并研究其生物学特性。方法将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中,构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒,然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。结果利用检测PCV2ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+,同时用Southernblotting证实外源基因PCV2ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验(IFA)和Westernblotting结果显示重组病毒中PCV2ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明,重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当,且重组病毒对小鼠无致病性,免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。结论重组伪狂犬病毒构建成功,且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。; 琚春梅陈焕春郗鑫刘正飞曹胜波; 关键词：猪2型圆环病毒 ORF2基因伪狂犬病毒

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究被引量：15: 2005年; 根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK- gE- LacZ+ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK- gE- gI- ORF1-ORF2 + ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK- gE- LacZ+ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。; 琚春梅陈焕春樊惠英刘正飞曹胜波

伪狂犬病毒诱导感染乳仔猪扁桃体淋巴细胞发生凋亡: 2005年; 将伪狂犬病毒Ea株,按100 TCID50的剂量感染15日龄的健康乳仔猪,所有实验组仔猪在接种后5～7天出现伪狂病症状,取感染组及对照组仔猪扁桃体,进行透射电镜观察、原位末端脱氧核苷酸标记等试验.透射电镜观察发现扁桃体的淋巴细胞发生凋亡,DNA原位末端脱氧核苷酸标记(TUNEL)呈阳性.; 石德时兰盛银李祥敏金梅林徐珍秀陈焕春; 关键词：PRV 乳仔猪 TUNEL

编码流感病毒血凝素基因和CD40L的核酸疫苗抗小鼠流感研究被引量：5: 2004年; 为了检测表达CD40L的质粒能否作为核酸疫苗佐剂提高A/PR8/34流感病毒血凝素(HA)DNA疫苗的免疫应答,构建了表达鼠CD40L的质粒,并将它与A型流感病毒的 HA DNA疫苗用电击的方法共同免疫BALB/C小鼠(各30礸),免疫两次,间隔三周,第二次免疫后1周,用致死量流感病毒A/PR8/34攻击。发现与单独免疫30礸 HA相比,血清中抗HA的IgG抗体量明显提高,且以IgG2a抗体提高为主,小鼠体重减轻非常少且体重恢复加快。实验结果显示,CD40L能作为流感病毒核酸疫苗佐剂,提高小鼠抗流感病毒攻击的能力。; 邹丽容方芳陈则; 关键词：流感病毒血凝素 CD40L 核酸疫苗免疫应答

猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达被引量：4: 2007年; 用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证明该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白。重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定。该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8TCID50/0.1mL。; 宋云峰肖少波曹胜波张松林陈焕春金梅林; 关键词：CAP蛋白 ORF2基因疫苗

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组伪狂犬病病毒的构建被引量：10: 2005年; 将SV40启动子控制下的LacZ基因表达盒和CMV启动子控制下的H3N2亚型猪流感病毒(SIV H3N2)的HA基因插入到伪狂犬病病毒(PRV)通用转移载体pBdTK-Uni中,获得转移载体pLTK-HA。将该载体与PRV Bartha-K61株基因组DNA通过脂质体法共转染Vero细胞,经过10代蓝斑筛选、纯化和PCR鉴定获得了一株插入SIV HA基因的重组伪狂犬病病毒,命名为rPRV-HA。Western blotting和间接免疫荧光试验证实HA基因在重组病毒感染的细胞中获得了表达。用不同的细胞(PK-15I、BRS-2、Vero和鸡胚成纤维细胞)对该重组病毒与亲本病毒的增殖滴度和致细胞病变进行比较,未见显著差异,对第30代重组病毒的HA基因进行序列分析,表明该重组病毒遗传性状稳定。; 周国辉倪健强田志军仇华吉李海燕童光志; 关键词：伪狂犬病病毒猪流感病毒重组病毒 HA

猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究被引量：19: 2005年; PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游,使二者融合表达,命名为pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠,分别注射pCD-NA3.1(+)、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2,共免疫2次,间隔2周,分别于首免后2周和二免后4周采血,ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达,将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体,构建了pNORF2和pNBVP22,转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示,通过两次免疫后,各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体,同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果,其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。; 宋云峰肖少波金梅林张松林陈焕春; 关键词：蛋白转导核酸疫苗

表达多个外源基因的重组伪狂犬病病毒的构建及其细胞培养特性研究被引量：6: 2007年; 将SV40启动子控制下的LacZ报告基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有猪瘟病毒(CSFV)E2基因及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5基因的表达盒插入到伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株TK基因中,通过蓝斑筛选获得了一株插入CSFV E2、PRRSV GP5与LacZ基因的重组伪狂犬病病毒,命名为rPRV-E2-GP5。经Westernblot、间接免疫荧光试验证实E2、GP5基因在重组病毒感染细胞中获得了表达。重组病毒感染Vero、PK-15、IBRS2和CEF细胞后的增殖滴度和致细胞病变特征与亲本病毒比较,无显著差异。本试验结果表明在PRV基因组中可以插入多个外源基因,为进一步研究多价基因工程载体疫苗奠定了基础。; 刘燕田志军周艳君仇华吉童光志; 关键词：重组伪狂犬病病毒猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒

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国家高技术研究发展计划(2001AA213051)

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