重庆医科大学基础医学院发育生物学研究室
- 作品数：5 被引量：12H指数：2
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- CRISPR/Cas9技术敲除faf1基因对斑马鱼软骨及肌节发育的影响被引量：4
- 2017年
- 目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼faf1基因,并研究faf1基因对斑马鱼发育的影响。方法针对斑马鱼faf1基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9 mRNA混合注入斑马鱼单细胞胚胎中,通过酶切和基因测序技术筛选出发生突变的F0代斑马鱼,将其与野生型斑马鱼外交得到F1代杂合体斑马鱼,检测其可遗传突变类型,并用显微镜观察、记录每一代斑马鱼表型。结果成功制备了faf1 gRNA和Cas9 mRNA。位于faf1 6号外显子的gRNA(gRNA6)能使faf1基因发生移码突变。筛选出可遗传突变类型(mutant 1,MU1)并观察到该杂合突变型斑马鱼有体细胞色素沉积延迟,受精后第4天开始尾部肌节出现"结节样"表型以及头颅缩小、舌骨小角角度增大等颅面软骨畸形的变化,并于受精后8~9 d死亡。结论利用CRISPR/Cas9敲除该基因产生了新的表型,即色素沉积延迟及尾部肌节部位出现"结节样"变化。
- 刘菁梁森袁志黄慧哲
- 关键词：斑马鱼软骨发育
- Smurf1通过抑制LKB1的多聚泛素化而调控其蛋白稳定性被引量：1
- 2019年
- 目的:为了探寻肝脏激酶B1(liver kinase B1,LKB1)的上游调控分子,并研究其对LKB1的影响。方法:首先,利用UbiBrowser数据库预测LKB1可能的上游调控分子,并根据评分筛选出可能对LKB1具有调控作用的Smurf1基因。然后,构建Smurf1和LKB1相关过表达质粒,并转染HEK293T细胞,通过Western blot检测LKB1蛋白质表达的变化。最后,运用荧光定量PCR(qPCR)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)探索Smurf1调控LKB1可能的分子机制。结果:①成功构建LKB1和Smurf1相关过表达质粒。②在HEK293T细胞中过表达0、0.5、1、2μg的野生型Smurf1时其对应的LKB1蛋白相对表达量分别为0.0262±0.0007、0.0727±0.0003、0.1301±0.0013、0.4315±0.0010。经单因素方差分析,其结果为F=79636.433,P=0.000。与0μg对照组相比,进一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各组P值分别为0.000、0.000和0.000。③在HEK293T细胞中过表达0、0.5、1、2μg的突变型Smurf1时其对应的LKB1的蛋白相对表达量分别为0.0180±0.0001、0.0530±0.0004、0.1250±0.0010、0.2004±0.0017。经单因素方差分析,其结果为F=12887.993,P=0.000。与0μg对照组相比,进一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各组P值分别为0.000、0.000和0.000。④以GAPDH为内参,未过表达Smurf1组和过表达Smurf1组中,LKB1的相对mRNA表达水平分别为1.0851±0.4125、2.3982±1.7669。经独立样本t检验统计分析,P=0.257。⑤以β-actin为内参,未经Smurf1处理组、野生型Smurf1(WT)处理组、突变型Smurf1(C699A)处理组中LKB1的相对泛素化水平分别为1.8238±0.0278、0.0881±0.0051、0.2127±0.0062。经单因素方差分析,其结果为F=6721.953,P=0.000。与未经Smurf1处理组相比,进一步采用LSD-t法分析,野生型Smurf1组和突变型Smurf1组各组P值分别为0.000和0.000。结论:这些结果表明Smurf1通过降低LKB1的多聚泛素化从而参与其蛋白稳定性的调节。
- 袁志马林强程志梁森黄慧哲
- 关键词：LKB1稳定性
- 聚焦超声对斑马鱼神经胶质瘤模型的治疗研究被引量：2
- 2015年
- 目的:通过研究聚焦超声对斑马鱼神经胶质瘤模型治疗后肿瘤组织和肿瘤血管的变化,探讨其对神经胶质瘤及肿瘤血管的影响。方法:将72只转基因斑马鱼(fli:GFP)随机分为3组,每组24只,分别是对照组(Fli组)、肿瘤组(U87组)、治疗组(U87+HIFU组)。在受精2 d后,对肿瘤组和治疗组注射神经胶质瘤细胞(U87-RFP),注射1 d后对治疗组进行聚焦超声治疗。在治疗后连续2 d用荧光显微镜观察3组斑马鱼的肿瘤大小及肿瘤血管增生情况,q PCR法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)Aa和血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)2的m RNA的表达情况。结果:U87组斑马鱼卵黄内有大量神经胶质瘤细胞且肿瘤血管明显增生,VEGF Aa和VEGFR2的m RNA表达升高(VEGF Aa:Fli:1.01±0.13 vs.U87:1.45±0.10,P=0.002;VEGFR2:Fli:1.01±0.12 vs.U87:1.41±0.07,P=0.001);经聚焦超声治疗后,斑马鱼卵黄内的神经胶质瘤细胞显著减少,血管增生不明显,VEGF Aa和VEGFR2的m RNA表达也较U87组降低(VEGF Aa:U87+HIFU:1.14±0.05 vs.U87:1.45±0.10,P=0.009;VEGFR2:U87+HIFU:1.16±0.06 vs.U87:1.41±0.07,P=0.012)。结论:聚焦超声能有效杀灭神经胶质瘤细胞,并且能减少肿瘤血管的生成,对治疗神经胶质瘤具有积极作用。
- 潘珠玛邢扬帆李发琪黄慧哲
- 关键词：聚焦超声高强度聚焦超声神经胶质瘤斑马鱼血管内皮生长因子血管内皮生长因子受体
- CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因及表型分析被引量：1
- 2019年
- 目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因,观察和验证纯合子表型,初步探讨Lkb1对肾小管发育的影响。方法针对斑马鱼lkb1基因设计并体外合成gRNA,通过显微注射技术将gRNA和Cas9 mRNA注入野生型胚胎一细胞期卵黄中,利用T7E1酶切和测序筛选出高效gRNA,通过测序筛选出F0代突变体及可遗传突变体,野生鱼和可遗传突变体鱼杂交产生F1代杂合子突变体,测序鉴定F1代杂合子突变类型,通过F1代杂合子自交产生F2代纯合子幼鱼,通过观察鉴定出纯合子表型;通过RT-PCR和免疫印迹验证纯合子表型。结果制备了斑马鱼lkb1 gRNA和Cas9 mRNA,筛选出3种产生移码突变的杂合子,发现斑马鱼lkb1基因敲除纯合子幼鱼受精后第5天游动时头尾剧烈摆动,异常兴奋,鱼鳔缺失,体轴弯曲,卵黄消耗过快,肝脏暗淡,肠道水肿;第9天大多数死亡;纯合子g6pase、pdk2b、pcpck1 mRNA显著升高,Lkb1完全不表达;肾小管标志蛋白mRNA显著升高。结论利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因产生了多种表现,包括肝脏衰竭、肠道水肿、体轴弯曲、鱼鳔缺失、早期致死的表型,同时表明Lkb1对斑马鱼肾小管发育有影响。
- 梁森李帅庭袁志黄慧哲
- 关键词：LKB1斑马鱼
- 异位表达FOXO4对胃癌细胞凋亡的影响被引量：4
- 2015年
- 目的应用p CMV5-Flag和p LL3.7真核表达载体构建Forkhead box O4(FOXO4)基因的过表达质粒和干扰RNA表达质粒,研究其对胃癌细胞凋亡的影响。方法将FOXO4基因的开放阅读框克隆入p CMV5-Flag载体,将靶向FOXO4基因的siRNA克隆入p LL3.7载体,获得FOXO4的表达质粒Flag-FOXO4和干扰质粒FOXO4-shRNA。将获得的质粒及对照质粒通过脂质体转染MKN45和SGC7901胃癌细胞,Western blot检测其对细胞中FOXO4蛋白的表达和沉默效率。FCM检测其对细胞凋亡的影响,Western blot检测Cleaved Caspase-3的表达以及应用Real-time PCR检测其对促凋亡转录因子BCL-6的表达的变化。结果成功构建FOXO4的表达质粒Flag-FOXO4和干扰质粒FOXO4-shRNA。Western blot结果表明,Flag-FOXO4可以明显增加细胞FOXO4的表达,FOXO4-shRNA明显抑制细胞FOXO4的表达。FCM结果显示,Flag-FOXO4组与Control组相比较,MKN45细胞和SGC7901细胞凋亡显著增加了16.54%(P<0.001)和26.23%(P<0.001)。Western blot结果显示Cleaved Caspase-3表达与FCM结果一致。Real-time PCR结果表明Flag-FOXO4组细胞FOXO4下游促凋亡基因BCL-6的表达显著增加(P<0.01),FOXO4-shRNA明显抑制了细胞BCL-6的表达(P<0.01)。结论 FOXO4的过表达可能通过增加FOXO4下游促凋亡基因BCL-6的表达促进了胃癌细胞的凋亡。FOXO4的沉默降低了BCL-6的表达。
- 赵亮高蕊刘菁黄慧哲
- 关键词：过表达RNA干扰细胞凋亡胃癌细胞
