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牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析被引量：2: 2016年; 旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P<0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P<0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。; 王明明赵志东李安宁张亚冉段美艳李世军吴森王晓宇昝林森; 关键词：基因克隆活性分析

秦川牛OLR1基因多态性与肉质性状的关联分析被引量：5: 2012年; 采用PCR-RFLP的方法对230头秦川肉牛基因组的氧化型低密度脂蛋白受体1(OLR1)基因进行研究,并对其基因型与部分肉质性状进行关联分析。结果发现,OLR1基因存在g.10497C>A突变,该突变位点能够被PstI限制性酶识别。群体中共存在3种基因型,分别命名为AA、AC和CC,基因型频率分别为0.287、0.217和0.496。等位基因A和C的基因频率分别为0.396和0.604。χ2检验表明,该基因座处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05)。关联分析结果表明,CC基因型的眼肌面积显著高于AA基因型(P<0.05);同样,CC基因型与高眼肌深度相关(P<0.05)。而AC基因型与AA和CC基因型之间没有显著差异(P>0.05);在背膘厚和肌间脂肪含量这2个性状上,3种基因型之间差异不显著(P>0.05)。; 李托赵志东王婧王昕; 关键词：肉质性状 PCR-RFLP

腺病毒与慢病毒感染牛肌肉原代细胞的研究被引量：1: 2016年; [目的]比较腺病毒和慢病毒侵染牛肌肉卫星细胞MOI值的差异,选择较优的侵染方式。[方法]从新生牛犊背最长肌中分离并纯化出牛肌肉卫星细胞,通过病毒侵染靶细胞的方法比较腺病毒和慢病毒对牛肌肉卫星细胞的侵染能力,确定最佳感染复数(Multiplicity of infection,MOI)。[结果]成功分离出牛肌肉卫星细胞,经过体外培养,可以用于细胞侵染研究;随着MOI值的增大,腺病毒和慢病毒侵染的细胞荧光强度均逐渐增强;当腺病毒侵染牛肌肉卫星细胞的MOI值为3 000,慢病毒侵染靶细胞的MOI值为300时,荧光强度均较强,细胞形态即将发生变化。相对而言,慢病毒较腺病毒更易侵染原代肌肉细胞,并且荧光强度较强,但侵染效率比较低。[结论]对于原代细胞,选择慢病毒侵染更为合适。该试验结果为应用腺病毒或慢病毒介导的功能基因在牛肌肉卫星细胞中的过表达或干扰沉默研究提供了参考资料。; 赵璐付长振赵志东昝林森刘永峰; 关键词：腺病毒慢病毒

KAP9.2基因的群体遗传变异及羊绒生长期和休止期基因的表达研究: 羊绒是由次级毛囊产生的，具有光滑、轻柔、细软等特点，是高档的纺织原料。羊绒品质与角蛋白和角蛋白相关蛋白有着密切的关系。KAP基因家族角蛋白相关蛋白9.2（KAP9.2）是超高硫角蛋白相关蛋白基因家族中的一员，可能在连接中...; 赵志东; 关键词：多态性羊绒绒山羊; 文献传递

羊绒生长期、休止期陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达被引量：9: 2012年; 【目的】研究角蛋白相关蛋白9.2基因(KAP9.2)和Hoxc13基因在羊绒生长不同阶段皮肤组织中的表达量对产绒量的影响,为羊绒生长的调控机理研究奠定基础。【方法】以陕北白绒山羊为研究对象,以奶山羊作为对照,利用qRT-PCR方法,检测羊绒生长期和休止期高产、低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达量。【结果】对于KAP9.2基因,在羊绒生长期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著低于低产绒量陕北白绒山羊(P<0.01),而在羊绒休止期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量却显著高于低产绒量陕北白绒山羊和奶山羊(P<0.05);对于Hoxc13基因,在羊绒休止期高产和低产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著高于奶山羊(P<0.01)。高产和低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因在生长期、休止期平均相对表达量的变化趋势相似,均表现为生长期极显著低于休止期(P<0.01)。【结论】KAP9.2对绒毛生长有抑制作用;Hoxc13对KAP9.2基因的表达可能具有调控作用。; 赵志东徐华荣屈雷杨莹王昕; 关键词：羊绒生长期陕北白绒山羊

奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法: 本发明奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列及其检测方法，属于基因工程技术领域，所述奶牛FGF2基因的单核苷酸多态性序列包括：奶牛FGF2基因第一内含子第11646位为A或G的单核苷酸多态性序列。所述检测方法为以奶牛基因组...; 王昕张智英张婷婷李托赵志东徐华荣; 文献传递

陕北白绒山羊KAP9.2基因腺病毒载体的构建及包装被引量：2: 2014年; 研究旨在构建能够表达KAP基因家族角蛋白相关蛋白9.2(KAP9.2)基因的腺病毒载体,为研究KAP9.2在绒山羊绒毛生长中的功能奠定基础。通过外科手术采集陕北白绒山羊皮肤组织,采用酚/氯仿法提取其基因组,设计引物,通过PCR技术扩增KAP9.2基因。通过酶切连接构建pAdTrack-KAP9.2穿梭载体。将该穿梭载体经Pme I线性化后与pAdEasy-1载体共转化到BJ5183细菌中进行重组,经过卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-KAP9.2。将pAdEasy-KAP9.2经Pac I酶切线性化后转染HEK293人胚肾细胞,培养7d后收集细胞,反复冻融破碎细胞,离心收集病毒。在病毒扩增4次后,采用LaSRT法测定其滴度。最终测得病毒滴度为1.34×108 GFU/mL。研究成功包装KAP9.2基因重组腺病毒颗粒。; 徐华荣郭杨赵志东李托张智英王昕; 关键词：重组腺病毒陕北白绒山羊

牛ATP5B基因启动子与组织差异性表达研究被引量：2: 2015年; 本研究旨在检测前期构建的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒在3T3L-1细胞系中的表达活性,检测ATP5B基因在不同组织中的差异表达情况。经脂质体法转染3T3L-1细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶相对活性,结合生物信息学软件进一步确认牛ATP5B基因可能的核心启动子;利用试剂盒从秦川牛的16个不同组织提取RNA,反转录后,先检测cDNA,再设计ATP5B基因定量引物和1对β-actin内参引物,进行实时荧光定量反应,最后,结合软件比对不同物种的ATP5B基因近端启动子和氨基酸序列。结果,通过转染细胞和荧光素酶活性分析,统计学分析证实重组质粒pATP5B-462荧光素酶活性最高,软件分析所对应的启动子区域-547^-230bp存在TATA盒、CAAT盒、GATA盒、v-Myb、deltaE这些重要转录调控元件。牛的ATP5B基因组织表达谱结果分析显示,该基因在后腿肌和背最长肌中相对高水平表达,在睾脂、心、瓣胃、皱胃、大肠、小肠、背脂、肾和肝中相对中度表达,在脾、肺、盲肠、瘤胃和网胃中相对微量表达。氨基酸序列比对结果显示,牛ATP5B基因与山羊、绵羊、小鼠、猪和人的ATP5B基因的相似性较高,牛ATP5B基因编码的氨基酸序列与山羊和绵羊的相似性分别高达99%、98%,与人和小鼠的相似性均为96%,与猪的相似性为91%。本研究初步确认了牛ATP5B基因可能的核心启动子,并得到了牛ATP5B基因在16个组织的表达谱结果,软件比对基因序列的结果进一步表明,ATP5B基因是一个较为保守的基因,这为进一步研究牛ATP5B基因的转录调控机制及功能都奠定了基础。; 段美艳赵志东李安宁李世军王明明昝林森; 关键词：启动子实时荧光定量PCR

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测被引量：4: 2015年; 【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763^-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763^-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。; 段美艳李安宁赵志东王明明昝林森

牛MYOZ1基因启动子活性分析被引量：1: 2016年; 【目的】鉴定牛MYOZ1基因转录起始位点,确定牛MYOZ1基因核心启动子区域,为进一步研究牛MYOZ1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】以秦川牛肌肉5′RACE准备cDNA为模板,设计5′RACE扩增试验,确定牛MYOZ1基因转录起始位点。以秦川牛外周血基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得牛MYOZ1基因转录调控区-1 628/+61目的片段。通过生物信息学分析软件预测可能包含的转录因子结合位点,设计逐段缺失引物,获得7个亚克隆,将其分别与pGL3-Basic载体连接,得到牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,通过脂质体法转染C2C12细胞系,检测7个重组质粒的荧光素酶活性,分析启动子活性。【结果】确定了牛MYOZ1基因的转录起始位点,成功克隆获得7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒:pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61,其中重组质粒pMYOZ1-116/+61启动子活性极显著高于pGL3-Basic,推测牛MYOZ1基因-116/+61区域可能包含核心启动子;重组质粒pMYOZ1-1 628/+61启动子活性极显著高于pMYOZ1-1 430/+61片段活性(P<0.01),表明牛MYOZ1基因启动子区域-1 628/-1 430片段可能包含启动子活性增强元件。生物信息学分析发现,牛MYOZ1基因启动子-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多个重要转录因子结合位点;-1 628/-1 430片段可能包含SP1、MyoD等多个重要转录因子结合位点。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且初步确定了牛MYOZ1基因的核心启动子区域位于-116/+61。; 王明明李安宁赵志东张亚冉段美艳王亚宁李世军昝林森; 关键词：启动子

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赵志东

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