王明明
- 作品数：5 被引量：7H指数：2
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家高技术研究发展计划国家肉牛牦牛产业技术体系项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析被引量：2
- 2016年
- 旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P<0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P<0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。
- 王明明赵志东李安宁张亚冉段美艳李世军吴森王晓宇昝林森
- 关键词：基因克隆活性分析
- 牛ATP5B基因启动子与组织差异性表达研究被引量：2
- 2015年
- 本研究旨在检测前期构建的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒在3T3L-1细胞系中的表达活性,检测ATP5B基因在不同组织中的差异表达情况。经脂质体法转染3T3L-1细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶相对活性,结合生物信息学软件进一步确认牛ATP5B基因可能的核心启动子;利用试剂盒从秦川牛的16个不同组织提取RNA,反转录后,先检测cDNA,再设计ATP5B基因定量引物和1对β-actin内参引物,进行实时荧光定量反应,最后,结合软件比对不同物种的ATP5B基因近端启动子和氨基酸序列。结果,通过转染细胞和荧光素酶活性分析,统计学分析证实重组质粒pATP5B-462荧光素酶活性最高,软件分析所对应的启动子区域-547^-230bp存在TATA盒、CAAT盒、GATA盒、v-Myb、deltaE这些重要转录调控元件。牛的ATP5B基因组织表达谱结果分析显示,该基因在后腿肌和背最长肌中相对高水平表达,在睾脂、心、瓣胃、皱胃、大肠、小肠、背脂、肾和肝中相对中度表达,在脾、肺、盲肠、瘤胃和网胃中相对微量表达。氨基酸序列比对结果显示,牛ATP5B基因与山羊、绵羊、小鼠、猪和人的ATP5B基因的相似性较高,牛ATP5B基因编码的氨基酸序列与山羊和绵羊的相似性分别高达99%、98%,与人和小鼠的相似性均为96%,与猪的相似性为91%。本研究初步确认了牛ATP5B基因可能的核心启动子,并得到了牛ATP5B基因在16个组织的表达谱结果,软件比对基因序列的结果进一步表明,ATP5B基因是一个较为保守的基因,这为进一步研究牛ATP5B基因的转录调控机制及功能都奠定了基础。
- 段美艳赵志东李安宁李世军王明明昝林森
- 关键词：启动子实时荧光定量PCR
- 牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测被引量：4
- 2015年
- 【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763^-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763^-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。
- 段美艳李安宁赵志东王明明昝林森
- 牛MYOZ1基因启动子活性分析被引量：1
- 2016年
- 【目的】鉴定牛MYOZ1基因转录起始位点,确定牛MYOZ1基因核心启动子区域,为进一步研究牛MYOZ1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】以秦川牛肌肉5′RACE准备cDNA为模板,设计5′RACE扩增试验,确定牛MYOZ1基因转录起始位点。以秦川牛外周血基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得牛MYOZ1基因转录调控区-1 628/+61目的片段。通过生物信息学分析软件预测可能包含的转录因子结合位点,设计逐段缺失引物,获得7个亚克隆,将其分别与pGL3-Basic载体连接,得到牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,通过脂质体法转染C2C12细胞系,检测7个重组质粒的荧光素酶活性,分析启动子活性。【结果】确定了牛MYOZ1基因的转录起始位点,成功克隆获得7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒:pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61,其中重组质粒pMYOZ1-116/+61启动子活性极显著高于pGL3-Basic,推测牛MYOZ1基因-116/+61区域可能包含核心启动子;重组质粒pMYOZ1-1 628/+61启动子活性极显著高于pMYOZ1-1 430/+61片段活性(P<0.01),表明牛MYOZ1基因启动子区域-1 628/-1 430片段可能包含启动子活性增强元件。生物信息学分析发现,牛MYOZ1基因启动子-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多个重要转录因子结合位点;-1 628/-1 430片段可能包含SP1、MyoD等多个重要转录因子结合位点。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且初步确定了牛MYOZ1基因的核心启动子区域位于-116/+61。
- 王明明李安宁赵志东张亚冉段美艳王亚宁李世军昝林森
- 关键词：启动子
- 牛PDHB基因的启动子克隆及其活性分析
- 李安宁赵志东王明明段美艳郝瑞杰昝林森
- 关键词：启动子
