王亚美
- 作品数：9 被引量：12H指数：2
- 供职机构：新疆大学生命科学与技术学院生物资源基因工程重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家级大学生创新创业训练计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 棉蚜His-CYP6J1融合蛋白的分离纯化及多克隆抗体的制备
- 2017年
- 通过亲和层析法纯化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白,制备及鉴定其多克隆抗体。采用镍离子金属螯合亲和层析柱分离纯化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白,SDS-PAGE检测纯化产物。用纯化得到的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠,制备抗棉蚜P450CYP6J1多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体效价;免疫组化法检测抗血清特异性。结果表明,纯化的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠后得到多抗血清,ELISA法检测抗血清效价达1∶200 000。免疫组化结果显示,此多克隆抗体能够与棉蚜P450 CYP6J1天然蛋白特异性结合,却在棉铃虫没有发现相应的结合反应。上述结果对研究棉蚜单一P450蛋白结构、功能及其在棉蚜抗药性形成过程的作用奠定基础。
- 王亚美魏原杰艾新宇刘小宁
- 关键词：P450蛋白纯化多克隆抗体
- 棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化被引量：3
- 2017年
- [目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。
- 艾新宇赵洁王亚美魏原杰刘小宁
- 关键词：棉铃虫原核表达乙醇脱氢酶
- 棉蚜P450 CYP6CY3的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备被引量：5
- 2017年
- 【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii)P450 CYP6CY3,将其开放阅读框(ORF)在原核细胞中进行表达,纯化融合蛋白,多次免疫小鼠获得CYP6CY3多克隆抗体,为进一步分析CYP6CY3在棉蚜不同组织部位的分布及其在抗性中的作用打下基础。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的ORF,并对其进行生物信息学及系统进化分析。构建重组质粒pET32a-CYP6CY3,转化大肠杆菌transetta(DE3)进行原核表达,利用切胶回收法获得纯化的融合蛋白,继而用纯化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制备鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗体;ELISA检测鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗体的效价,并通过Western blot及免疫组化检测该抗体特异性。【结果】棉蚜CYP6CY3 ORF长1 266 bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量为48.8 k D,理论等电点为8.99,不含有信号肽序列,属亲水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5个P450家族的特征基序。通过NCBI Blastx进行同源序列的比对分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,达到81%,与麦双尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性为79%,与桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性为76%,4种蚜虫的氨基酸序列都含有位于螺旋K中参与稳定核心结构的E××R完全保守序列及P450基因标志性的F××G×××C×G(358—367)血红素结合位点的共有序列。使用MEGA5软件构建系统进化树,显示棉蚜、豌豆长管蚜、麦双尾蚜及桃蚜聚为一类,亲缘关系较近。通过原核表达得到的CYP6CY3融合蛋白的相对分子量约为66 k D,基于纯化的CYP6CY3重组蛋白多次免疫昆明白小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测获得的鼠抗CYP6CY3抗体效价达到1﹕409 600。Western blot和免疫组化进一步证实,该抗体既能与异源表达的CYP6CY3蛋白特异性结合,也能与棉蚜组织中存在的天然CYP6CY3蛋白特异�
- 魏原杰王亚美黄丽娜刘宁赵洁艾新宇刘小宁
- 关键词：棉蚜原核表达蛋白纯化多克隆抗体
- 棉铃虫类肌钙蛋白基因的克隆、原核表达纯化及其时空表达谱分析
- 2018年
- 为探索棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)类肌钙蛋白基因HaCal的生理功能及其所编码蛋白的生物特性,采用PCR方法克隆了HaCal的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,借助在线软件对其进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达和纯化其编码的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术分析其在棉铃虫不同发育龄期和组织中的表达量。结果显示,HaCal的ORF序列长度为564 bp,编码187个氨基酸,理论分子量为20.52 kD,理论等电点为7.64。其保守结构域与Calponin家族一致,但不含跨膜区和信号肽,系亲水性蛋白。原核表达结果显示,融合蛋白大小与理论值一致,纯化获得了纯度较高的目的蛋白。HaCal在棉铃虫幼虫不同发育阶段和不同组织中均有表达,在6龄幼虫体内表达量最高,是1龄幼虫的2.34倍;在5龄幼虫中肠中表达量最高,是头部的257.14倍。表明棉铃虫类肌钙蛋白基因HaCal可能与棉铃虫的生长发育过程密切相关。
- 艾新宇赵洁王亚美魏原杰刘小宁
- 关键词：生物信息学分析棉铃虫
- 棉蚜细胞色素P450 CYP6J1的克隆与表达
- 2016年
- 为了深入了解细胞色素P450 CYP6J1蛋白的结构和功能,本实验克隆获得了棉蚜Aphis gossypii P450CYP6J1基因,对该基因进行信息学及原核表达分析,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达结果,并用Western-blot进行验证。结果表明,P450 CYP6J1序列长1 398 bp,编码氨基酸数为465,理论分子量为53.67 k D,理论等电点为8.80。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。同源性分析表明,棉蚜c DNA序列推导的氨基酸与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的保守性最为接近,一致性可达92%。在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得的His-CYP6J1蛋白,并用Western-blot检测目的蛋白大小正确。这些研究结果为棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗体制备提供了基础。
- 王亚美黄丽娜艾新宇魏原杰刘小宁高希武
- 关键词：棉蚜P450克隆蛋白表达
- 水分胁迫对3种纤维亚麻种子萌发的影响被引量：2
- 2013年
- 采用不同质量分数的聚乙二醇(PEG)模拟水分胁迫,研究3种纤维亚麻种子萌发和胚根生长对PEG的生理响应。结果表明:3个品种种子对10%PEG均不敏感,15%PEG是这3个品种种子萌发的敏感浓度;不同品种对水分胁迫的响应程度有所差异,经25%PEG处理,YOI 303的发芽率、发芽指数较高;经20%PEG处理,天鑫3号的发芽势较高;经20%、25%PEG处理,天鑫3号的胚根较长。
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- 关键词：水分胁迫发芽率发芽指数发芽势
- PEG和干旱胁迫对3种纤维亚麻幼苗理化特性的影响被引量：2
- 2014年
- 旨在为筛选耐旱的纤维亚麻种质提供参考。选用‘天鑫3号’、‘YOI303’、‘双亚5号’3个纤维亚麻品种种子经培养皿滤纸法进行PEG胁迫种子萌发试验,萌芽种子经盆栽获得幼苗,对幼苗进行了盆栽控水试验,研究了幼苗对干旱胁迫的理化响应。结果表明,随着干旱胁迫的加剧,3个品种纤维亚麻幼苗的株高、根长、叶绿素含量有下降趋势,脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、CAT活性呈总体上升趋势,但不同种源的变化幅度有所不同。综合评价认为,‘YOI303’亚麻品种耐旱性最好,其次是‘天鑫3号’与‘双亚5号’。
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- 关键词：PEG胁迫幼苗干旱胁迫理化特性
- 棉蚜P450CYP6J1的克隆表达、融合蛋白的纯化、多克隆抗体的制备及鉴定
- 细胞色素P450(CYP450)是一类以血红素为辅基的B 族细胞色素超家族,是昆虫体内的一种很重要的解毒酶系,它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢.该家族成员在催化反应过程中具有的高度特异性使其在...
- 王亚美黄丽娜艾新宇魏原杰刘小宁
- 关键词：棉蚜克隆蛋白表达蛋白纯化多克隆抗体免疫组织化学
- EMS诱变加干旱胁迫对YOI303纤维亚麻幼苗理化特性的影响被引量：1
- 2014年
- 【目的】为筛选耐旱纤维亚麻的诱变条件奠定基础。【方法】选用YOI303纤维亚麻品种种子经不同时间和浓度EMS诱变处理后,对处理的种芽盆栽后得到的幼苗进行控水试验,研究幼苗对干旱胁迫的理化响应。【结果】随着干旱胁迫的加剧,YOI303纤维亚麻幼苗的株高有下降趋势,而根长、可溶性蛋白含量、丙二醛含量、POD活性呈总体上升趋势,但不同时间和浓度EMS处理组幼苗在多种理化指标差异较大。【结论】经0.05%EMS处理3 h所得的幼苗耐旱性最好,其次是0.025%EMS处理9 h组和0.1%EMS处理3 h组。
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- 关键词：EMS诱变幼苗干旱胁迫理化特性
