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人结核杆菌热休克蛋白70启动子对外源基因在分枝杆菌中表达的影响被引量：6: 1997年; 利用聚合酶链反应技术（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增得到１５０ｂｐ的人结核杆菌热休克蛋白（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）７０启动子和约６５０ｂｐ的外源基因日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）的ｃＤＮＡ片段。并采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定了人结核杆菌ＨＳＰ７０起始密码ＡＴＧ上游１５０ｂｐ的启动子序列。在这一区域可见与大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－３５和－１０区同源的碱基顺序ＴＴＧＡＧ和ＡＴＣＡＴＡ，以及ＡＴＧ上游－１２～－８处的核糖体结合位点ＧＧＡＧＧ。然后将人结核杆菌ＨＳＰ７０启动子和日本血吸虫ＧＳＴ编码基因克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中，构成能表达日本血吸虫ＧＳＴ基因的Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达载体ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６。电转化耻垢分枝杆菌后，用卡那霉素筛选出阳性重组子。含有ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６的耻垢分枝杆菌在热和过氧化氢的作用下均诱导出ＧＳＴ的表达。其表达产物分子量为２６×１０３，经聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）后，扫描分析，表明重组ＧＳＴ（ｒＧＳＴ）占菌体总蛋白的１０％。本研究为Ｈ?; 程继忠皇甫永穆冯作化梁驹卿肖红; 关键词：结核分枝杆菌热休克蛋白启动子基因表达

HSP70基因上游调控序列对GST基因在耻垢分枝杆菌中表达效率的影响被引量：1: 1999年; 将外源基因———日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因克隆到大肠杆菌分枝杆菌穿梭质粒中，构建成四个不同的表达截体，研究它们在耻垢后分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅｇｍａｔｉｓ）中的表达效率。首先将含有结核杆菌热休克蛋白７０（ＨｅａｔＳｈｏｃｋＰｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ７０）的启动子的质粒ｐＭＴ７０用ＮｃｏＩ切，进行两种不同的修饰后，得到不同的ＳＤ序列；将Ｓｊ２６ＧＳＴ基因克隆进去。再将含ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因的片段切下，克隆到分枝杆菌大肠杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ２０００中，筛选出不同ＳＤ序列、不同方向和不同拷贝数的分枝杆菌表达载体四个。所表达的重组天然Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白，在ＳＤＳＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带。通过薄层扫描分析，发现表达质粒中双拷贝启动子外源基因组合，表达效率最高，是单拷贝组合的１６倍，占分枝杆菌菌体总蛋白的２８％。而不同的克隆方向和不同的ＳＤ序列（两者相差３个碱基）对表达效率的影响不明显。; 程继忠皇甫永穆海涛梁驹卿肖红; 关键词：上游调控序列分枝杆菌 GST基因

日本血吸虫基因工程BCG多价疫苗的研究被引量：8: 1998年; 用日本血吸虫（Sj）成虫提取的总RNA逆转录合成CDNA第一链，并设计合成引物，经PCR扩增，扩增出26kDa的编码区基因，并进行了测序，结果表明Sj中国大陆株（SjC）、Sj菲律宾株（SjP）26kDaGST基因核苷酸同源性99．8％．然后，构建了大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG－Sj26Ⅰ-Ⅳ．再将其依次分别转化大肠杆菌、耻垢分枝杆菌和BCG中，筛选出重组耻垢分枝杆菌疫苗和重组BCG多价疫苗．经SDS－PAGE和薄层扫描分析表明，Sj26kDaGST的表达效率在大肠杆菌、耻垢分校杆菌和BCG中分别占菌体总蛋白的25％-37％、10％－28％、10％－15％．通过酶切图谱、PCR技术和Westernblot分析，证实构建的Sj26kDa基因工程BCG多价疫苗是成功的．用其免疫BABL／c小鼠，结果表明它对日本血吸虫的感染有明显的预防作用，重组BCG多价疫苗的减虫率达27．36％（t=3．42，P＜0．01），减卵率达60．50％（t=6．19，P＜0．01）．实验组虫卵肉芽肿平均面积以及免疫后血清抗体水平与对照组相比其差别具有显著意义．该研究为日本血吸虫成虫疫苗的研究提供了一条新的途径．; 石佑恩韩家俊李文桂石星李传明邓伟文皇甫永穆郑波程继忠冯作化梁驹卿肖红路艳艳曾星海涛; 关键词：日本血吸虫病基因工程

日本血吸虫菲律宾株26kDa抗原的表达、纯化与应用被引量：3: 1998年; 利用亲和层析和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等分子生物学技术，表达、纯化、鉴定了重组日本血吸虫菲律宾株２６ｋＤａ抗原（ｒＳｊｐ２６ＧＳＴ），并比较了其与日本血吸虫大陆株２６ｋＤａ抗原（ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ）基因ｃＤＮＡ序列的异同，分析了其应用前景。分别以质粒ｐＧＥＸ和血吸虫大陆株总ＲＮＡ为模板，经ＰＣＲ或逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出的Ｓｊｐ２６ＧＳＴ和Ｓｊｃ２６ＧＳＴｃＤＮＡ，其片段长度均为６５４ｂｐ。通过双脱氧测序结果显示两者碱基排列顺序相同。用大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表达载体在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达Ｓｊｐ２６ＧＳＴ，ｒＳｊｐ２６ＧＳＴ占菌体总蛋白的２５％。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析柱一步纯化法，得到纯品Ｓｊｐ２６ＧＳＴ，将其作为靶抗原用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测血吸虫大陆株感染者和感染小鼠血清及用Ｓｊｃ２６ＧＳＴ免疫的小鼠血清，反应均为阳性。本研究提示Ｓｊｐ２６ＧＳＴ与Ｓｊｃ２６ＧＳＴ在ＤＮＡ序列、氨基酸顺序和抗原性等方面高度同源。; 程继忠梁驹卿肖红肖红皇甫永穆; 关键词：日本血吸虫纯化 RT-PCR

日本血吸虫32ku抗原基因的克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达被引量：12: 2000年; 日本血吸虫３２ｋｕ抗原（简称ｓｊ３２ｋｕ）是血吸虫的一种保护性抗原，为研究其重组疫苗的保护作用，将该抗原基因的全编码序列按正确的阅读框顺序插入到穿梭质粒ｐＢＣＧ２１００，受控于人结核杆菌热休克蛋白７０（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏ－ｔｅｉｎ７０，简称ｈｓｐ７０）启动子，构建成重组表达质粒ｐＢＣＧ－ｓｊ３２，在大肠杆菌－分枝杆菌两个系统中能稳定复制。重组分枝杆菌于４２℃诱导２ｈ或４５℃诱导３０ｍｉｎ，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，在３２ｋｕ的位置能见到明显的蛋白条带，表明３２ｋｕ抗原能在分枝杆菌中高效表达。; 肖红郑波祁学忠皇甫永穆; 关键词：分枝杆菌日本血吸虫疫苗基因表达

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定被引量：5: 1997年; 用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。; 程继忠梁驹卿肖红海涛皇甫永穆; 关键词：结核杆菌卡介苗启动子热休克蛋白

日本血吸虫中国大陆株成虫谷胱甘肽S-转移酶cDNA克隆及其核昔酸顺序分析被引量：2: 1998年; 日本血吸虫成虫26kD谷胱甘肽S-转移酶（Sj26KDGST）是成虫代谢过程中一个关键酶。为研究制备日本血吸虫重组疫苗，根据日本血吸虫菲律宾株成虫Sj26kDGST完整编码区序列设计引物，以日本血吸虫中国大陆株成虫26kDGSTmRNA为模板，采用逆转录-聚合酶链反应技术，扩增了其26kDGST完整编码区cDNA。将cDNA重组于pBluescriptSK质粒上，转化大肠杆菌，重组体经限制酶解图谱鉴定，用双脱氧链末端终止法对克隆的编码区CDNA的5’端和3’端大部分顺序进行测定，结果与菲律宾株成虫蜀26kDGST编码区CDNA进行了比较，表明二者顺序一致。为表达和制备血吸虫重组疫苗奠定了初步的基础。; 梁驹卿肖红皇甫永穆程继忠王光惠曾星; 关键词：日本血吸虫逆转录 GST

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肖红

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