阮萍
- 作品数：35 被引量：106H指数：6
- 供职机构：绍兴文理学院医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省自然科学基金浙江省医药卫生科学研究基金更多>>
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- 甲型副伤寒杆菌ompA基因分布及重组表达产物的免疫学鉴定被引量：6
- 2010年
- 目的构建甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统，确定其重组表达产物rOmpA免疫原性和保护作用，检测甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率。方法采用PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增ompA基因，T-A克隆后测序并构建ompA基因原核表达系统。采用SDS-PAGE和Bio—Rad凝胶图像分析系统检测rOmpA表达情况及其产量，采用免疫扩散法、微量肥达试验和Western blot鉴定其抗原性和免疫反应性。采用PCR检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率。采用小鼠感染模型，了解rOmpA对甲型副伤寒杆菌50001株感染的免疫保护作用。结果与报道的相关序列比较，所克隆的ompA基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。rOmpA表达量约为细菌总蛋白的65％。rOmpA能与其兔抗血清和甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生免疫反应（Western blot），并可在家兔中诱导产生抗体。94．9％（93／98）甲型副伤寒杆菌临床菌株含有ompA基因。100μg和200μg rOmpA对感染小鼠的免疫保护率分别为41．7％（5／12）和58．3％（7／12）。rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1：5～1：40。结论ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中分布广泛。rOmpA有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用，可考虑为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原。
- 蒋锦琴阮萍丁威孙爱华毛亚飞严杰
- 关键词：甲型副伤寒杆菌免疫原性免疫保护性
- 问号钩端螺旋体鞭毛蛋白相关蛋白FliH／I／Y／N基因原核表达和膜定位被引量：1
- 2008年
- 目的克隆问号钩端螺旋体（简称钩体）鞭毛相关蛋白编码基因fliH、fliI、fliY和fliN并构建其原核表达系统，制备表达产物抗血清并了解其蛋白的定位。方法以苯酚-氯仿法提取的问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板，用PCR扩增全长fliH、fliI、fliY和fliN基因片段，T-A克隆后测序，继而构建上述目的基因克隆的原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图像分析系统检查重组蛋白rFliH、rFliI、rFliY和rFliN的表达情况，Ni-NTA亲和层析法提纯目的表达产物。皮下免疫家兔获得4种目的重组蛋白抗血清，用ELISA和Western blot分别检测抗血清效价并了解抗血清与相应抗原结合的能力。采用免疫电镜技术对fliH、fliI、fliY和fliN进行定位。结果PCR扩增获得大小分别为924、1365、1065和318 bp的全长fliH、fliI、fliY和fliN基因片段，与报道的序列比较，其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统均能有效地表达目的重组蛋白，其产量均约为20％。rFliH、rFliI、rFliY和rFliN蛋白免疫家兔后能产生抗体，其兔抗血清ELISA效价达到1：100000以上，并分别识别钩体相应重组蛋白和膜蛋白提取物而出现明显的Western杂交条带。fliH、fliI、fliY和fliN蛋白分布于问号钩体内膜、外膜或内外膜之间。结论本研究成功地构建了能高效表达问号钩体鞭毛相关蛋白fliH、fliI、fliY和fliN的原核表达系统，并获得了能有效识别上述蛋白抗原的高效价抗血清。鞭毛相关蛋白fliH、fliI、fliY和fliN是问号钩体内膜或外膜蛋白成分。
- 徐韩飞阮萍廖苏梅杨平毛亚飞李立伟严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体原核表达
- motA基因在空肠弯曲菌致病性相关趋化和定植中的作用被引量：2
- 2010年
- 目的确定鞭毛马达蛋白（flagellarmotorprotein）MotA编码基因在空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）致病性相关趋化和定植中的作用。方法采用PCR扩增motA基因以及用于motA基因敲除的Kan。基因和plus—motA基因片段，目的扩增产物克隆后测序。根据同源重组原理，构建空肠弯曲菌NCTClll68株motA基因自杀质粒（pBlueskrit-Ⅱ-SKmotA-kan）和motA基因敲除突变株（motA-）。采用半固体平板迁移试验、基于硬琼脂平板（hardagarplus，HAP）的脱氧胆酸钠（SDC）体外趋化试验、小鼠空肠定植试验，了解空肠弯曲菌motA-突变株和野生株鞭毛动力、SDC趋化和BALB／c-ByJ小鼠空肠内定植能力差异性。结果所克隆的空肠弯曲菌motA基因核苷酸和氨基酸序列与已报道的相应序列相似性为100％。PCR和测序及含抗生素培养基连续传代培养结果证实，自杀质粒和motA-突变株构建成功。motA-突变株在半固体琼脂平板上的菌斑直径、在HAP上对0．2mol／LSDC趋化聚集环直径、黏附于小鼠空肠黏膜表面以及空肠内容物中motA-突变株数量均明显少于野生株（P〈0．05）。结论本研究成功构建了空肠弯曲菌motA基因敲除突变株。motA基因是空肠弯曲菌鞭毛动力以及致病性相关趋化和定植的必需基因。
- 阮萍孙爱华赵欣严杰
- 关键词：空肠弯曲菌趋化定植
- 香露兜叶提取物抗氧化与辐射效应影响被引量：12
- 2018年
- 为研究辐射效应对香露兜叶提取物的影响,本研究中利用超声波萃取技术进行香露兜叶的萃取,再以总多酚、总类黄酮、DPPH自由基清除率、亚铁离子螯合等非酵素系统进行香露兜叶提取物抗氧化能力的评估。以过氧化氢诱发氧化压力的毒性效应测试香露兜叶提取物细胞内抗氧化的能力,再以5.5戈雷（Gy）的辐射剂量照射,用MTT分析方法测定细胞的存活率,评估香露兜叶提取物对辐射效应的影响。研究结果显示香露兜叶总多酚含量为（139.89±0.43） GAE mg/g,总类黄酮含量为（44.24±0.61） RE mg/g,DPPH与亚铁离子螯合的IC50分别为（5.87±0.02） mg/mL和（15.3±0.07） mg/mL。在H2O2对细胞伤害的实验中,香露兜叶提取物对于肝癌细胞（HepG2）有显著（p〈0.05）的毒杀作用,且细胞存活率会随着提取物浓度增加而增高杀死细胞的比率。萃取液浓度分别为25 g/mL、250 g/mL、1 000 g/mL和1 500 g/mL时,经过72 h培养后,细胞存活率分别为64.7%、50.4%、37.5%和30.6%。低浓度香露兜提取物对于HepG2细胞有辐射增敏作用,以浓度为25 g/mL的香露兜提取物合并5.5 Gy的辐射剂量照射,发现其存活率由单独以5.5 Gy辐射剂量照射的54.58%降至12.11%。综合以上的结果,香露兜叶提取物具有不错的抗氧化能力,并且有不错的辐射效应影响能力。
- 陈新蕾阮萍
- 关键词：抗氧化
- 甲型副伤寒杆菌侵袭蛋白(spaO)基因原核表达及免疫性和保护作用研究被引量：2
- 2006年
- 目的研究甲型副伤寒杆菌spaO基因重组表达产物rSpaO免疫性和保护作用,并了解甲型副伤寒杆菌临床菌株spaO基因携带和表达情况。方法扩增并克隆甲型副伤寒杆菌临床株 JH01 spaO基因,构建原核表达系统;采用SDS-PAGE分析rSpaO表达情况,Ni-NTA亲和层析法收集 rSpaO,采用Western blot鉴定其免疫反应性;采用PCR和ELISA检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株 spaO基因携带和表达频率;观察rSpaO对甲型副伤寒杆菌50001株感染小鼠的免疫保护作用。结果与报道的相关序列比较,克隆的spaO基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99．45％-99．89％和 99．01％-100％;rSpaO表达量为细菌总蛋白的75％左右;甲型副伤寒杆菌全菌抗血清能识别rSpaO; rSpaO免疫家兔可产生抗体;94．9％(93／98)甲型副伤寒杆菌临床菌株含有spaO基因,91．4％(85／93) spaO+菌株表达SpaO。rSpaO灌喂或皮下注射免疫小鼠(500μg)受甲型副伤寒杆菌50001株攻击后的存活率分别为58．3％和50．0％;若加入5μg rLTB,存活率分别上升88．3％和75．0％。结论甲型副伤寒杆菌临床菌株有较高的spaO基因携带率和表达率;rSpaO有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗的候选抗原。
- 毛亚飞林晓骥李晶阮萍周晓辉严杰
- 关键词：甲型副伤寒杆菌原核表达
- 护理学专业基础医学课程新体系的构建被引量：4
- 2010年
- 结合本科护理学专业应用型人才培养模式,立足专业培养目标,突出专业特色,遵循"三结合"和"五适应"的原则,教学内容以实践为中心,以适用、够用为原则,对传统护理学专业以学科为中心的基础医学课程进行优化和重组,构建为以器官系统为中心、以"结构—功能—人体与环境"为主线的人体形态学、人体机能学、病原生物学与免疫学的基础医学课程体系.
- 张金萍刘文庆刘丽华阮萍
- 关键词：应用型人才护理学课程体系
- 问号钩端螺旋体rLTB/rCTB-LipL32/1免疫保护作用及野生株LipL32基因表达和患者抗体检测被引量：5
- 2005年
- 目的 构建LTB- LipL32/ 1和CTB- LipL32 / 1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用,了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率。方法 采用常规分子生物学技术构建LTB- LipL32 / 1和CTB- LipL32 /1融合基因及其原核表达系统。采用SDS PAGE检测目的重组蛋白rLTB -LipL32 / 1及rCTB -LipL32 / 1表达情况。分别采用Westernblot和GM1 -ELISA检测rLTB -LipL32 / 1及rCTB -LipL32 /1的免疫反应性和佐剂活性。采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株LipL32基因及其表达情况。采用ELISA检测2 2 8例钩体病人血清LipL32基因产物的抗体。采用豚鼠保护试验检测重组蛋白的免疫保护作用。结果 与报道的相关序列比较,LTB -LipL32 /1和CTB- LipL32 / 1融合基因核苷酸序列相似性分别为99.12 %～99.71%和98.5 4 %～99.4 2 % ,氨基酸序列相似性分别为97.5 8%～99.6 3%和96 .77%～99.6 3%。rLTB- LipL32 1和rCTB- LipL32 /1表达产量均约为细菌总蛋白的10 % ,并主要以包涵体形式存在。rLTB -LipL32 / 1和rCTB- LipL32 /1均分别能与LipL32 /1兔抗血清和牛GM1结合。97.9%(95 97)问号钩体野生株含有LipL32基因,95 .9% (93 97)问?
- 阮萍严杰毛亚飞周晓辉
- 关键词：问号钩端螺旋体LTB基因霍乱弧菌
- 甲型副伤寒沙门菌spaO—ompA融合基因构建及其表达产物免疫保护作用
- 2012年
- 目的构建甲型副伤寒沙门菌spaO—ompA融合基因及其原核表达系统，确定重组表达产物rSpaO—OmpA免疫保护作用。方法采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因，构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE和Bio—Rad凝胶图像分析系统检测目的重组表达产物rSpaO—OmpA表达情况及其产量。采用免疫扩散法、微量肥达和Westernblot法鉴定rSpaO—OmpA抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rSpaO—OmpA对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用，实验中采用重组表达的SpaO（rSpaO）及OmpA（rOmpA）作为对照。结果所构建的spaO-ompA融合基因与spaO或ompA单基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统EcoliBk21DE3pET42a-spaO-ompA能高效表达重组融合蛋白rSpaO-OmpA。rSpaO-OmpA能与甲型副伤寒沙门菌全菌抗血清结合并产生阳性杂交信号，免疫家兔后可产生特异性抗体。100汕g或2006xgrSpaO—OmpA对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率分别为66．7％（8／12）和83．3％（10／12），明显高于等量rSpaO及rOmpA（P〈0．05）。rSpaO—OmpA免疫小鼠血清与不同副伤寒沙门菌H抗原的凝集效价为1：5～1：40、与rSpaO和rOmpA及rSpaO—OmpA免疫双扩散效价为1：1～1：16。结论人工融合重组抗原rSpaO—OmpA免疫原性和免疫保护作用较等量rSpaO或rOmpA更强。
- 蒋锦琴孙一帆岳文燕严杰阮萍
- 关键词：甲型副伤寒沙门菌免疫保护性
- 钩端螺旋体外膜蛋白 Loa22优势 T-B联合抗原表位及其免疫原性研究被引量：1
- 2015年
- 目的：筛选并鉴定致病性问号钩端螺旋体（简称钩体）外膜蛋白Loa22优势T细胞和B细胞（ T／B）联合抗原表位及其免疫原性。方法采用PCR检测我国流行的8群8型株问号钩体loa22基因，T-A克隆后测序。构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株loa22基因原核表达系统。 Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白rLoa22并制备其兔抗血清及其IgG。采用生物信息学软件预测Loa22的T-B联合抗原表位。采用噬菌体展示联合Western blot法、ELISA分别检测重组噬菌体PⅢ蛋白展示的T-B联合表位肽和人工合成T-B联合表位肽的免疫原性。采用MTS法和ELISA分别检测T-B联合表位肽诱导T细胞活化及其分泌IL-2、IL-4和IFN-γ情况。结果所有受检的致病性钩体株均能检出loa22基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性高达85．5％～99．8％和93．9％～99．5％。所构建的loa22基因原核表达系统能高效表达rLoa22。 Loa22-77、Loa22-90、Loa22-125和Loa22-157这4个T-B联合抗原表位中，仅有Loa22-90显示了很强的Western blot阳性条带。 Loa22-90能有效诱导CD4＋T细胞增殖及IL-2（Th1）和IL-4（Th2）水平显著升高（P＜0．05）。结论 Loa22是问号钩体序列保守的属特异性外膜蛋白抗原，其优势T-B联合抗原表位为Loa22-90，该表位可作为钩端螺旋体多抗原肽疫苗的候选表位。
- 阮萍赵金方李阳严杰胡玮琳
- 关键词：钩端螺旋体外膜蛋白免疫原性
- 人单核-巨噬细胞和中性粒细胞杀灭问号钩端螺旋体能力差异及其机制被引量：2
- 2017年
- 目的 了解人单核-巨噬细胞和中性粒细胞杀灭问号钩端螺旋体（简称钩体）能力差异及其机制.方法 人THP-1单核细胞和HL-60细胞分别用佛波酯（PMA）和全反式维甲酸（ATRA）预处理,使其分化为单核-巨噬细胞和中性粒细胞.采用激光共聚焦显微镜法检测问号钩体黄疸出血群赖型赖株感染THP-1单核-巨噬细胞和HL-60中性粒细胞内总活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）水平和游离钙离子浓度（[Ca2＋]i）变化.采用荧光分光光度法检测总ROS、NO抑制剂和胞内游离Ca2＋螯合剂（NAC、SMT和BAPTA/AM）作用前后THP-1单核-巨噬细胞和HL-60中性粒细胞杀灭胞内问号钩体的能力及其差异.结果 THP-1单核-巨噬细胞和HL-60中性粒细胞感染问号钩体后总ROS、NO水平和[Ca2＋]i均显著升高（P〈0.05）,但前者总ROS、NO水平和[Ca2＋]i显著高于后者（P〈0.05）.THP-1单核-巨噬细胞杀灭胞内问号钩体能力显著强于HL-60中性粒细胞（P〈0.05）.抑制胞内总ROS、NO和游离Ca2＋可导致THP-1单核-巨噬细胞杀灭胞内问号钩体能力显著下降（P〈0.05）,但对HL-60中性粒细胞无明显影响.结论 单核-巨噬细胞而非中性粒细胞是感染时清除问号钩体的主要吞噬细胞,高水平总ROS、NO和胞内游离Ca2＋与单核-巨噬细胞杀灭问号钩体能力密切相关.
- 阮萍林旭瑷张颖颖周海丽严杰陈旭
- 关键词：问号钩端螺旋体单核-巨噬细胞INTRACELLULARCA2+
