王亮
- 作品数：16 被引量：97H指数：6
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项中国农业科学院哈尔滨兽医研究所所长基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定被引量：6
- 2008年
- 以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别。以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠。筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11。Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应。抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF11分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链。相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位。
- 乔祖健王亮李媛陈超辛九庆李继昌
- 关键词：猪肺炎霉形体热休克蛋白70单克隆抗体
- 猪肺炎支原体P97 C末端基因重组腺病毒的构建与鉴定
- 从猪肺炎支原体基因组中扩增其黏附因子P97C末端基因,然后通过KpnⅠ和SalⅠ酶切位点把该基因克隆入经过同样双酶切的穿梭载体pShuttle-CMV中。将鉴定正确的的重组穿梭质粒经PemⅠ线性化后电转化入内含腺病毒骨架...
- 陈超辛九庆李媛王亮郭丹曹培丽乔祖建
- 关键词：猪肺炎支原体猪喘气病重组腺病毒
- 文献传递
- 猪肺炎支原体p52基因重组腺病毒及其构建方法和应用
- 本发明公开了猪肺炎支原体p52基因重组腺病毒及其构建方法和应用。本发明将p52基因克隆到穿梭载体pShuttle－CMV中经线性化后，电转化入BJ5183菌内与其含有的骨架载体pAdEasy－1同源重组，再与脂质体混合转...
- 辛九庆李媛曹培丽陈超郭丹王亮乔祖建
- 文献传递
- 猪呼吸系统综合征病原与免疫被引量：3
- 2007年
- 辛九庆王亮乔祖建张建华
- 关键词：呼吸系统综合征病原猪呼吸系统综合症呼吸系统疾病免疫PRDC
- 猪肺炎支原体P97 C末端蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位分析被引量：4
- 2010年
- 以大肠杆菌表达的pET-30a-P97C重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备针对猪肺炎支原体P97C末端蛋白的单克隆抗体,并将其与截短表达的P97C末端蛋白进行免疫印迹分析,初步鉴定了P97C末端蛋白的抗原表位。进一步采用肽探针扫描技术确定最小抗原决定区域,并通过生长抑制试验及抗黏附特性试验对抗原表位进行了分析。结果显示,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株A3C9和B4D5,并成功鉴定出P97C末端蛋白的2个独立线性表位F905PMAFSY911和G991TPNQGKKAE1000。2株单抗对猪肺炎支原体的生长均有一定的抑制作用,但对其黏附特性没有显著抑制作用。
- 张美晶王亮李媛董慧姜海芳陈超曹培丽郭丹辛九庆
- 关键词：猪肺炎支原体单克隆抗体抗原表位
- 猪肺炎支原体p97 C末端基因重组腺病毒的构建及其免疫效果被引量：7
- 2009年
- 【目的】构建携猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)黏附因子p97C末端基因的重组腺病毒并研究其诱导小鼠产生的免疫反应,为研制新型Mhp疫苗奠定基础。【方法】从Mhp基因组中扩增p97C末端基因,并将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,该重组穿梭质粒经PmeI线性化后电转化到BJ5183-AD-1细胞中进行同源重组获得重组腺病毒DNA,纯化后的重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞以获得重组腺病毒。对该重组腺病毒进行RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定,用氯化铯密度梯度离心纯化试剂盒对该重组腺病毒进行纯化并确定其滴度。重组病毒经肌注、滴鼻两种途径免疫小鼠并从体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫3个方面对其免疫结果进行分析。【结果】PacⅠ酶切证实同源重组成功,RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定证明了该重组腺病毒成功转录并表达了p97C末端蛋白,将该重组病毒进行纯化后滴度可达到5×1011TCID50/mL,重组病毒可诱导小鼠产生血清、肺匀浆液特异性IgG,通过滴鼻免疫方式还可诱导肺匀浆液SIgA的产生,但不能诱导特异的淋巴细胞增值。【结论】成功构建了表达p97末端基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的的体液免疫和粘膜免疫,但不产生细胞免疫应答。
- 陈超李媛郭丹曹培丽张美晶姜海芳乔祖建王亮辛九庆
- 关键词：猪肺炎支原体猪支原体肺炎重组腺病毒免疫效果
- 丝状支原体丝状亚种SC型LppC基因的表达纯化
- 2008年
- 丝状支原体丝状亚种SC型是A类烈性传染病牛传染性胸膜肺炎的病原体。脂蛋白LppC是重要的免疫优势抗原,LppC基因是MmmSC的特异性基因。本研究通过PCR方法,扩增MmmSC标准株PG1的LppCN末端基因。将该序列克隆到pMDT-18载体上并测序,用pET32a为载体构建重组质粒进行诱导表达。LppCN末端基因长度为644bp,将其与NCBI上发布的Afade株、欧洲群代表株L2比较,它的核酸序列同源性为100%,表明LppC基因在种内高度保守。原核表达结果得到大小为45ku的目的蛋白,用Ni-NTA系统进行纯化得到高纯度的蛋白,Westernblot结果表明,重组蛋白能与牛传染性胸膜肺炎阳性血清反应,具有免疫学活性,为进一步与LppQ融合表达奠定基础。
- 李媛乔祖健王亮张建华辛九庆
- 一株山羊支原体山羊肺炎亚种的分离鉴定与分子特征被引量：42
- 2007年
- 从送检的山羊肺炎肺脏中成功分离到一株支原体,经过3次克隆纯化后进行生化试验、电镜观察、PCR及酶切、基因特征鉴定,结果显示分离物SD3属于山羊支原体山羊肺炎亚种成员。将培养物经气管接种2只山羊可引起1只山羊典型发病,体温升高至41.5℃,IgG和IgM抗体效价明显升高,其中IgG抗体变化与临床表现基本同步。剖检发现肺脏发生严重病变,并从中再次分离到该病原体。
- 辛九庆李媛张建华胡守萍王亮
- 关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种
- 猪肺炎支原体主要免疫蛋白Hsp70的克隆与原核表达
- 由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae Mhp)引起的猪支原体肺炎(MPS)或猪地方流行性肺炎,是造成养猪业经济损失的最重要的疾病之一。MPS以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点...
- 李媛辛九庆张建华王亮
- 文献传递
- 猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70(Dnak)的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析被引量：17
- 2008年
- 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK基因即Hsp70基因全长1 803 bp,编码600 aa,第631～633位TGA在支原体编码色氨酸而不是作为终止密码子。将该序列与多种致病支原体DnaK基因进行分析比较,发现Yin-1株与232株、J株、7 448株等MHP菌株的DNA同源性为99.3%～99.4%,氨基酸同源性为99.2%～99.3%,而与非同种支原体的DNA和氨基酸同源性仅为64.5%～74.4%和59.3%～77%。这表明DnaK基因在种内高度保守,种间差异较大。以pET28a为载体构建重组质粒,原核表达DnaK C末端大小为1 kb左右的基因,对表达的蛋白进行纯化后,通过Western blot检测它的免疫活性。原核表达得到大小为41 ku的目的蛋白,经Western blot证实,纯化蛋白可与MHP阳性猪血清反应,具有免疫活性。
- 李媛张建华王亮乔祖建辛九庆
- 关键词：猪肺炎支原体猪喘气病热休克蛋白70
