韦光辉
- 作品数：20 被引量：28H指数：3
- 供职机构：河南科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家高技术研究发展计划河南省基础与前沿技术研究计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建被引量：1
- 2010年
- 从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。
- 索剑飞雷雪芹徐廷生赵绍杰韦光辉
- 关键词：克隆真核表达载体增强型绿色荧光蛋白
- 转牛生长激素基因鸡的研究
- 生长激素,是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一类单链多肽类激素,它是一种具有广泛生理功能的生长调节素。能影响几乎所有的组织和细胞,其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化,调节蛋白质、糖及脂肪的代谢。与动物生长发育、繁殖等密...
- 韦光辉
- 关键词：生长激素显微注射转基因鸡EGFP
- 文献传递
- 山羊iPS细胞诱导及培养体系的优化
- 2014年
- 为了高效、持续的诱导获得并培养山羊诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS),本研究从饲养层和培养液方面进行优化。将分离获得3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblast,GEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×105 mL-1 MEF、1×105mL-1 GEF、5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的密度接种,以高糖DMEM+20%胎牛血清(FBS)和KnockoutDMEM+20%血清替代物(KSR)为培养液,研究不同饲养层种类和培养液对山羊iPS细胞获得和培养的影响。结果显示,山羊iPS细胞在接种密度为5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20%KSR组合的培养液,山羊iPS细胞的诱导效率以及消化传代后的克隆形成率均极显著高于其他5组(P<0.01)。对该组培养的山羊iPS细胞进行碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性;Oct4、SSEA-1、Tra-1-60、Tra-1-81免疫荧光检测呈阳性;RT-PCR检测有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog基因的表达;体外能分化形成类胚体。结果表明,将细胞接种在密度为5×104 mL-1 MEF+5×104 mL-1 GEF的饲养层上,使用KnockoutDMEM+20%KSR的培养液更适合山羊iPS细胞的获得和培养。本试验为山羊iPS细胞的体外研究、临床试验、动物基因组修饰和山羊胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)的建系奠定基础。
- 邱峰龙左其生李东李伟陈庭锋韦光辉李碧春
- 关键词：饲养层培养液IPS细胞山羊
- 徐淮山羊H-FABP基因克隆、表达产物亚细胞定位的研究及转基因小鼠的制备被引量：7
- 2012年
- 旨在克隆徐淮山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的cDNA,探讨其生物信息学功能。通过EGFP融合蛋白对该基因亚细胞水平的表达定位,探究该基因在异种生物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性。采用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆徐淮山羊H-FABP基因cDNA,进行生物信息学分析,构建其融合表达载体pEGFP-H-FABP。脂质体(LTX)介导基因转染山羊成纤维细胞(GEF),48h后进行荧光检测,RT-PCR检测mRNA在细胞内的表达。利用睾丸注射将目的基因转入小鼠体内,在DNA和蛋白水平上检测目的基因的表达情况。结果,徐淮山羊H-FABP基因完整编码区(CDS)大小为402bp,编码133个氨基酸,GenBank登录号为AY466498.1。徐淮山羊H-FABP序列与人、鸡、褐家鼠、奶牛、野猪、驴及斑马鱼相应编码区同源性为89%、76%、85%、84%、93%、91%、70%,氨基酸序列同源性为90%、79%、88%、97%、95%、94%、72%。成功构建融合表达载体pEGFP-H-FABP,目的基因在mRNA水平上成功表达。目的蛋白定位于细胞质中,与在线预测结果相同(无信号肽,定位于细胞质中)。通过尾静脉注射和睾丸注射,该基因可以在小鼠体内实现暂态表达和持续性表达。本研究成功克隆了徐淮山羊H-FABP基因cDNA,而且H-FABP基因在进化过程中是保守的。该蛋白无信号肽,在单细胞水平上可表达于细胞质中,在小鼠体内也可以成功表达。
- 阴彦辉韦光辉李伟朱才业张亚妮杜立新曹文广李碧春
- 关键词：徐淮山羊心脏型脂肪酸结合蛋白荧光蛋白转基因鼠
- 山羊骨骼肌卫星细胞系分离、培养及其成肌诱导分化研究被引量：3
- 2013年
- 采用外科手术方法从山羊四肢肌肉或背最长肌获取3mm×3mm肌肉束,置于1mg.mL-1 IV胶原酶中,室温消化30min,分散肌丝,在体视显微镜下分离肌丝;再用0.25%胰酶-EDTA于37℃下消化10min,以释放出骨骼肌卫星细胞(SSC)和其他细胞。连续5代在增殖培养体系(80%DMEM/F12+10%胎牛血清+10%马血清)中采用差速贴壁方法,收集接种后20min的贴壁细胞,对纯化的SSC采用免疫荧光方法检测SSC特异标志蛋白Pax-7,结果表明:(92.5±3.4)%细胞表达Pax-7,(93.0±1.8)%细胞表达MyoD,说明90%以上细胞为SSC。将纯化的SSC细胞分别在诱导培养体系Ⅰ(93%DMEM/F12+1%胎牛血清+1%马血清+1%non-AA)和II(99%Opti-MEM+1%non-AA)中进行诱导培养,通过细胞形态学观察和成肌细胞早期标志蛋白Desmin、MyHC免疫荧光检测诱导效果,结果表明:采用体系Ⅱ能在各种细胞密度(大于1×105个.cm-2)下诱导山羊SSC向成肌方向分化,而采用体系Ⅰ(低血清培养基)且仅当能诱导高密度山羊SSC向成肌方向分化。采用改进的SSC分离方法能够获得较高纯度的卫星细胞,比较诱导体系Ⅰ、Ⅱ认为,诱导培养体系Ⅱ适合于山羊SSC成肌诱导分化,为进一步研究SSC成肌分化机制提供素材。
- 李伟郑蒙蒙邱峰龙朱才业韦光辉王丹李碧春
- 关键词：山羊骨骼肌卫星细胞细胞培养
- 徐淮山羊多能性转录因子mRNA制备及在成纤维细胞中的表达
- 2014年
- 【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子0ct4、Sox2、K1f4和c—Myc的CDS片段,构建pMD19-T—oct4、pMD19-T—sox2、pMD19-T—k1f4和pMD19-T—c—myc重组质粒,随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-k1f4和pcDNA3-c—myc重组质粒,通过体外转录,获得该4种多能性转录因子的mRNA,并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT—PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因编码全序列,将该4种基因分别克隆到pMD19-T载体,构建pMD19-T—oct4、pMD19-T—sox2、pMD19-T-k1f4和pMD19-T—c—myc重组质粒。然后将pcDNA3.0载体和pMD19-T重组载体双酶切后用T4连接酶连接,构建含有T7启动子的真核表达载体pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-k1f4和pcDNA3-c—myc重组质粒。各重组质粒分别用限制性内切酶XhoI、XbaI单酶切,酶切后质粒模版按照体外转录试剂盒说明体外转录获得各多能性转录因子的mRNA,并对获得的mRNA进行检测,确定其稳定性和浓度。按照脂质体(体积):mRNA(质量)为1:1的比例用脂质体2000转染。转染24 h后,利用Western blot技术、间接免疫荧光实验检测徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因的mRNA在成纤维细胞中的表达。【结果】①克隆得到的徐淮山羊0ct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因编码序列全长分别为1 083、962、1 434和1 320 bp,并经TA克隆测序验证,其CDS序列与绵羊、人、牛和猪等的序列相似性在89%以上;②体外转录获得的4种多能性转录因子的mRNA经脂质体转染徐淮山羊成纤维细胞,在成纤维细胞中均定位于细胞核;③4种多能性转录因子的mRNA在徐淮山羊成纤维细胞中表达的蛋白与预期大小一致,分别为38、34、50和48 kd。【结论】成功克隆了徐淮山羊Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因,该4种多能性转录因子的mRNA能够在徐淮山羊成纤维细胞中稳定
- 邱峰龙张亚妮倪蓉李伟陈庭锋韦光辉李碧春
- 关键词：徐淮山羊体外转录MRNA
- 徐淮山羊SCD1基因的克隆和亚细胞定位研究及转基因小鼠的制备被引量：1
- 2013年
- 【目的】克隆徐淮山羊硬脂酰辅酶A脱氢酶1(SCD1)基因的cDNA并分析该基因生物信息学功能。通过EGFP融合蛋白在亚细胞水平定位该基因表达产物,研究该基因在异种动物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性及外源基因能否稳定遗传。【方法】采用RT-PCR方法从徐淮山羊脂肪组织中克隆SCD1基因cDNA,进行生物信息学分析,并构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-SCD1,脂质体(LTX)介导基因转染NHI-3T3细胞,48 h后荧光倒置显微镜下观察基因表达产物的分布,RT-PCR检测mRNA在体外水平的表达。利用睾丸注射法制备转基因小鼠,在F1代和F2代个体DNA水平和蛋白水平上检测目的基因的表达情况。【结果】成功克隆出徐淮山羊SCD1基因的全序列cDNA,大小为1 074 bp,编码357个氨基酸,GenBank登录号为JX854036,徐淮山羊SCD1序列与人、褐家鼠、小家鼠、绵羊、牛和野猪相应编码区的同源性分别为86%、83%、82%、98%、95%、90%,氨基酸序列同源性分别为84%、79%、79%、96%、92%、95%;成功构建了融合表达载体pEGFP-C1-SCD1;RT-PCR检测mRNA表达明显;EGFP-SCD1融合蛋白定位在NIT-3T3细胞质中,与在线软件预测一致;通过尾静脉注射和睾丸注射,该基因可以在小鼠体内暂态表达和持续性表达,且可以稳定遗传。【结论】体外克隆的徐淮山羊SCD1基因cDNA在单细胞水平上表达于细胞质中,在小鼠体内也可以表达。
- 朱才业韦光辉李伟王丹郑蒙蒙刘志永张亚妮李碧春
- 关键词：徐淮山羊荧光蛋白转基因鼠
- 过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化被引量：7
- 2013年
- 【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白(ehanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTMLTX转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1的开放阅读框(ORF)两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418(400μg.mL-1)筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。
- 李伟郑蒙蒙张亚妮朱才业邱峰龙韦光辉李碧春
- 关键词：基因克隆异位表达成肌分化
- 种蛋开口后不同封口方法对鸡胚孵化率的影响
- 20世纪90年代以来，鸡胚胎体外培养方法的建立使鸡的转基因技术取得了新的进展.但由于鸡胚换壳操作难免使鸡胚出现不同程度的损坏，造成鸡胚非自然因素的死亡，同时鸡胚的换壳操作也会增加鸡胚受污染的机会，因此其孵化率极低，前人研...
- 宋祯李振红雷雪芹徐廷生韦光辉
- 关键词：种蛋孵化率
- 徐淮山羊Oct4启动子功能的初步分析被引量：1
- 2014年
- 为确定徐淮山羊Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)基因启动子活性区域,并初步探讨TSA(Trichostatin A)和VPA(Valproic acid)对Oct4基因启动子活性的调控作用,文章采用Primer5.0设计包含Oct4基因启动子不同长度片段的特异性PCR引物,扩增并定向克隆至PGL3-Bacic荧光素酶报告载体,分别转染gEF、P19和COS7细胞,通过TSA和VPA诱导,进行双荧光报告基因活性检测。同时用Oct4启动子–1516^+30 bp片段替换pEGFP-N1中的CMV启动子,通过GFP荧光表达检测Oct4启动子的活性。结果表明:在gEF、P19和COS7细胞中Oct4启动子各片段均表现出不同程度的活性,且最强活性区域为上游–1516^+30 bp,基本活性区域为–238^+30 bp;在–1516~–946 bp、–615~–96 bp区域存在正调控元件,在–1936~–1516 bp、–946~–615 bp区域存在负调控元件;终浓度为1μmol/L的TSA和4 mmol/L的VPA为诱导的最佳浓度,均能显著增强Oct4基因启动子的活性;–1516^+30 bp片段能够启动GFP的表达。研究结果为揭示Oct4基因的转录调控机制奠定了基础。
- 韦光辉李东左其生张亚妮朱睿张蕾刘志永邱峰龙李碧春
- 关键词：OCT4启动子活性TSAVPA
