韩延平
- 作品数：45 被引量：232H指数：8
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- 建立基于RNA免疫共沉淀技术的鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关sRNA的体内验证方法被引量：1
- 2013年
- 目的:建立RNA免疫共沉淀方法,为鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关非编码小RNA(sRNA)提供体内验证方法。方法:首先在RNA结合蛋白Hfq下游加入Flag标签,用Flag标签抗体进行免疫共沉淀,获得蛋白-RNA复合物,然后从沉淀的蛋白-RNA复合物中分离得到纯化的RNA;通过Western印迹检测各步骤Hfq蛋白的表达,再利用Northern印迹检测目的sRNA——RyhB1和RyhB2。结果:构建了带有Flag标签的RNA结合蛋白Hfq的载体,此载体转导入hfq缺失株后与鼠疫菌野生株的生长曲线无明显差异;通过RNA-蛋白免疫共沉淀技术鉴定出已知与鼠疫菌Hfq蛋白结合的2个sRNA——RyhB1和RyhB2。结论:建立了利用RNA-蛋白免疫共沉淀鉴定与鼠疫菌Hfq蛋白结合的sRNA的技术,为细菌sRNA的验证、功能研究和体内蛋白质与RNA相互作用研究提供了有利工具。
- 孟祥荣苏山春邓仲良刘子中杨瑞馥韩延平黄新祥
- 关键词：鼠疫耶尔森菌
- FM4-64和Hoechst染料在活细菌胞膜和拟核标记定位中的条件优化与应用被引量：1
- 2015年
- 【目的】为了观察细菌细胞膜和拟核的形态结构,准确对亚细胞进行定位。【方法】本文利用FM4-64和Hoechst两种染料,分别采用不同浓度和不同时间对大肠杆菌活细胞进行染色和荧光共聚焦显微成像,并对7种细菌的活细胞(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鼠疫耶尔森菌、军团菌、霍乱弧菌和炭疽芽孢杆菌)进行染色观察。【结果】相同观察条件下,不同染料浓度和不同的染色时间影响了细胞膜、拟核的荧光强度;确定了FM4-64染色通用条件(浓度20μg/m L染色1 min)和Hoechst的最佳条件(浓度20μg/m L染色20min)。上述条件下,Hoechst对8种细菌染色效果均较理想,然而FM4-64对细菌染色效果不同,革兰氏阴性菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鼠疫耶尔森菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌和军团菌)表现较好的细胞膜轮廓,革兰氏阳性菌(炭疽芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)效果较差。【结论】FM4-64和Hoechst两种染料共染8种细菌,对细胞膜和拟核的染色观察,可为原核细胞结构染色提供借鉴,并为大分子的亚细胞定位研究奠定基础。
- 王净韩延平杨瑞馥赵兴绪
- 关键词：细胞膜
- 环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森菌被引量：5
- 2015年
- 目的建立简单、快速环介导恒温扩增技术(LAMP)检测鼠疫耶尔森菌的方法。方法基于鼠疫菌染色体上特异的核酸序列3a设计引物;应用浊度仪和目视法对反应结果进行检测;通过对鼠疫菌和其他近源菌同时进行检测评价方法的特异性;通过对不同稀释浓度的鼠疫菌DNA模板进行LAMP和PCR检测以确定方法的灵敏度。结果用建立的LAMP法对与鼠疫菌近源30种其他菌株进行扩增,结果均为阴性,该方法具有很高的特异性。LAMP法检测鼠疫菌DNA的灵敏度可达到20 pg,比常规PCR法高10倍。检测反应在25 min以内完成。结论该方法具有快速、灵敏、特异、操作简单的特点,有望发展成为现场快速检测鼠疫菌的有效手段。
- 冯娜周亚洲范艳晓汪琼毕玉晶韩延平杨瑞馥周育森王效义
- 关键词：鼠疫耶尔森菌
- 鼠疫菌OxyR调控子蛋白对rovA基因的转录调控研究
- 2013年
- 应用分子生物学技术,开展鼠疫菌调控子蛋白OxyR对rovAR的转录调控机制研究。提取鼠疫菌野生株(WT)和oxyR突变株(ΔoxyR)的总RNA,采用引物延伸试验研究rovAR的转录起始位点,并根据产物的丰度判断OxyR对rovAR的调控关系。构建克隆有rovAR上游启动子区的lacZ重组质粒,将重组质粒转入WT和ΔoxyR中,通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较2株重组菌中的rovAR启动子活性,进一步验证OxyR对rovAR的调控关系。进而利用大肠埃希菌OxyR识别基序,预测OxyR对rovAR启动子区的结合位点。发现rovAR的2个转录起始位点均受OxyR的激活,且rovAR启动子区具有可能的OxyR结合位点。推测OxyR能直接结合到rovAR启动子区而激活其转录表达。
- 倪斌刘磊黄新祥韩延平
- 关键词：鼠疫耶尔森菌OXYR转录调控
- 鼠疫耶尔森菌外源获得性pPCP1质粒编码小RNA的筛选、鉴定与功能的初步研究
- 2015年
- 目的鉴定鼠疫耶尔森菌外源获得性p PCP1质粒编码的小RNA,并评价其在生物膜、压力耐受性和毒力方面的功能。方法基于前期鼠疫菌转录组测序结果,分析获得外源性p PCP1质粒编码的高丰度小RNA,提取鼠疫菌总RNA,利用Northern印迹实验验证这些小RNA存在与否。利用λ-Red同源重组技术敲除p PCP1质粒上已证实的小RNA,并对小RNA缺失株在生物膜褶皱形成、高盐耐受性和致病性等方面进行初步的表型筛选。结果与结论 Northern印迹法鉴定了鼠疫菌p PCP1质粒上7个小RNA的存在。在此基础上,获得5个小RNA的缺失突变株,其中sR3446缺失后鼠疫菌生物膜褶皱形成能力减弱;sR3446、sR3457、sR4338和sR4340缺失后鼠疫菌对高盐环境的耐受能力减弱,而sR6143缺失后对高盐环境的耐受能力增强;sR4338和sR4340缺失后鼠疫菌毒力有所减弱。上述结果提示,鼠疫菌外源获得性p PCP1质粒上的小RNA在鼠疫菌应激和致病过程中可能发挥重要作用。
- 王红朵刘子中王子迎杨瑞馥韩延平
- 关键词：鼠疫耶尔森菌小RNA毒力
- 鼠疫耶尔森菌Pla毒力蛋白的表达、纯化及其活性研究被引量：2
- 2015年
- 目的制备鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)重组纤溶酶原激活剂(Pla)蛋白,为研究鼠疫菌蛋白之间相互作用和鼠疫的免疫学诊断奠定基础。方法应用PCR从鼠疫菌基因组中扩增pla基因,将其克隆到p ET28a表达载体中;转化大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达;SDS-PAGE电泳检测表达结果;应用8 mol/L尿素将包涵体变性,梯度稀释透析法将其复性,SDS-PAGE电泳和Western印迹检测目的蛋白;奶粉平板法检测纤溶酶原激活剂活性。结果与结论琼脂糖凝胶电泳和测序结果证明表达质粒构建成功;SDS-PAGE电泳结果表明Pla蛋白以包涵体形式表达,表达产物主要为目的蛋白,且目的蛋白的表达量较高;包涵体经变性、复性得到了电泳纯Pla蛋白,并具有纤溶酶原激活剂活性。该研究提供了一种简单、快速、高效制备具有活性的Pla蛋白的方法。
- 范艳晓周亚洲冯娜汪琼毕玉晶韩延平杨瑞馥王效义
- 关键词：鼠疫耶尔森菌纯化
- 鼠疫耶尔森菌中长度在100 nt以内的小RNA缺失株及过表达菌株的构建
- 2017年
- 目的构建鼠疫耶尔森菌中长度在100 nt以内的小RNA缺失株及过表达菌株的方法。方法在高拷贝质粒pBAD/HisA的基础上利用定点突变试剂盒制备一个可诱导的转录融合载体作为小RNA的过表达质粒。通过转录组测序、引物延伸并参考已有文献,预测了目的小RNA的存在、大小以及转录起始位点等,将目的小RNA的全长导入到改造后的质粒中并构建小RNA的过表达菌株。结果与结论成功构建了小RNA sR01、sR02、sR03、HmsA 4株缺失株以及小RNA MicF、HmsA、CpxQ 3株过表达菌株。建立了基于λ-Red同源重组、100 nt以内短片段小RNA敲除方法和基于定点突变试剂盒改造质粒的小RNA过表达菌株构建方法。
- 高肖芳刘子中李文亮王红朵杨瑞馥韩延平
- 关键词：鼠疫菌小RNA过表达
- 模拟失重对大肠杆菌K12基因表达及表型的影响被引量：4
- 2017年
- 【目的】通过低剪切力模拟失重(Low-shear modeled microgravity,LSMMG)连续传代培养大肠杆菌,检测大肠杆菌在模拟失重条件下的表型变化及基因改变。【方法】利用旋转细胞培养系统模拟失重环境对大肠杆菌K12进行连续传代培养,对菌株进行增殖速率、耐酸性和生物膜形成的测定,以此评估LSMMG对大肠杆菌K12表型的影响。利用转录组测序检测模拟失重条件下差异表达的基因,与表型作比对。【结果】模拟失重导致大肠杆菌增殖速率降低,耐酸性下降,生物膜形成能力增强;模拟失重条件下,营养代谢相关差异表达基因有25个,其中20个表达下降,2个与耐酸相关基因表达均下降。【结论】模拟失重会引起大肠杆菌表型及相应的基因变化,其中生物膜形成能力的增强可能对航天飞行造成潜在威胁。
- 容丹王佳平王海立高建义韩延平杨瑞馥李勇枝
- 关键词：模拟失重大肠杆菌转录组测序
- 鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片的研制及用于比较基因组学分析被引量：22
- 2004年
- 目的 研制鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片 ,并将其用于比较基因组分析。方法 挑选出 4 0 0 5条鼠疫耶尔森菌基因 ,PCR扩增各基因 ,以纯化的PCR产物点样制备芯片 ,采用双色荧光杂交策略 ,进行芯片比较基因组杂交。结果 设计了若干质控杂交组合 ,芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。
- 周冬生韩延平戴二黑宋亚军包静月裴德翠李敏崔百忠张秀清童宗中王津郭兆彪祁芝珍金丽霞翟俊辉杜宗敏王效义汪建黄培堂杨瑞馥
- 关键词：耶尔森氏菌鼠疫DNA芯片比较基因组学
- 鼠疫耶尔森菌基因组进化与生态位适应研究被引量：79
- 2004年
- 目的 探索鼠疫耶尔森菌基因组进化的基本规律及其与该菌在自然界适应性演化之间的内在联系。方法 对 36株鼠疫耶尔森菌和 7株假结核耶尔森菌进行芯片比较基因组分析 ,鉴定差异区段 (DFR) ,并对 2 6 0株鼠疫耶尔森菌进行PCR验证 ,分析各DFR在这些鼠疫耶尔森菌中的分布 ,同时进行基因组岛分析。结果 在鼠疫耶尔森菌基因组中鉴定出 2 2个DFR ,基于DFR图谱 ,将鼠疫耶尔森菌中国分离株分成 14个基因组型。鼠疫耶尔森菌共有 2 1个基因组岛 ,其中 18个已存在于假结核杆菌中 ,余下 3个为鼠疫耶尔森菌独有。结论 探明了各基因组岛在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌间的差异分布 ,探究了鼠疫耶尔森菌的起源进化 ;建立了鼠疫耶尔森菌基因组分型系统 ;建立了各基因组型别间的系统发育关系 ,初步揭示了鼠疫耶尔森菌基因组的进化规律及其与鼠疫耶尔森菌生态位适应和鼠疫疫源地扩展之间的关系 。
- 周冬生韩延平宋亚军童宗中裴德翠戴二黑张玲包静月李敏崔百忠张秀清王津郭兆彪祁芝珍金丽霞翟俊辉杜宗敏王效义汪建黄培堂杨瑞馥
- 关键词：耶尔森氏菌鼠疫DNA芯片基因组进化
