刘大斌
- 作品数：22 被引量：36H指数：4
- 供职机构：军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 利用移码突变和终止密码子提高下游目的基因的表达水平被引量：3
- 2011年
- 目的:在基因结构复杂的慢病毒载体插入报告基因并提高目的基因表达量。方法:慢病毒载体上有复杂的基因排列,为了不影响慢病毒载体的活性,必须尽量保留原有的基因,替换不必要的基因。首先将报告基因萤光素酶插入慢病毒载体替换基因Env后,结果检测不到报告基因的表达。为了提高报告基因的表达水平,将报告基因的读码框向后移动一个碱基,同时在其上游增加一个终止密码子,然后检测报告基因的表达水平。结果:通过移动报告基因的读码框同时在上游增加终止密码子,使报告基因的表达水平大大提高。结论:在构建基因表达载体时,通过改变目的基因与上游起始密码子ATG之间的相对位置以及增加终止密码子,可以大幅提高目的基因的表达水平。
- 陈斌李建彬米志强安小平李存刘大斌姜焕焕王娟黄芬张宝中范华昊何后军童贻刚
- 关键词：慢病毒载体报告基因基因表达定点突变
- 抗禽流感病毒H5N1分泌型IgA在中国仓鼠卵巢细胞中的表达被引量：1
- 2011年
- 分泌型IgA(SIgA)在机体的粘膜免疫中具有重要作用,在外分泌道中比单体IgA和IgG抗体具有更好的抗感染活性。为了表达抗禽流感病毒H5N1人-鼠嵌合分泌型IgA抗体,首先以本室先前构建的稳定表达IgA的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系为基础,共转染分泌片和J链表达质粒,然后用抗生素Zeocin选择阳性克隆细胞,利用倍比稀释的方法筛选分泌SIgA的单克隆细胞,通过Western blotting分析培养上清中SIgA的表达情况。结果表明,在CHO细胞中成功表达了SIgA抗体,上述研究为研制分泌型IgA抗体制剂奠定了良好的基础。
- 李存张宝中安小平米志强刘大斌姜焕焕潘博王盛陈斌黄芬王娟王晓娜童贻刚
- 关键词：WESTERNBLOTTING
- 抗-αvβ3scFv-sTF双功能融合蛋白的可溶性表达及其特性研究
- 肿瘤血管靶向治疗的策略由来已久,它通过抑制肿瘤的新生血管生成来阻断肿瘤组织养分的供给,达到抑制肿瘤的生长的目的。这种治疗方案具有毒副作用小、不会产生抗药性、广谱性等优点。整合素家族是一类细胞粘附分子,整合素αvβ3在肿瘤...
- 刘大斌
- 关键词：血管发生整合素ΑVΒ3单链抗体
- 文献传递
- 一种基于荧光素酶的HIV药物筛选细胞模型
- 目的：构建基于荧光素酶的单次感染HIV药物筛选细胞模型用于抗HIV药物筛选。
方法:构建含荧光素酶报告基因luc的假型慢病毒质粒，将VSV—G外膜糖蛋白的表达质粒，HIV-1 Rev蛋白表达质粒，HIV Gag...
- 张昕张宝中安小平刘大斌王盛李敬云周育森童贻刚
- 关键词：荧光素酶基因HIV感染药物筛选细胞模型
- 文献传递
- 结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化
- 2012年
- 目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。
- 王晓娜刘大斌安小平李存李建彬范华昊张文慧张博米志强童贻刚
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达纯化
- 基于核酶自剪切机制稳定分泌丙型肝炎病毒的细胞模型
- 2010年
- 目的 利用核酶自剪切机制建立稳定分泌HCV的细胞膜型.方法 以HCV感染性克隆的全基因组cDNA重组质粒为基础,在基因组两侧引入核酶序列,构建重组质粒pJFH1-核酶,并转染入HepG2细胞,加入G418溶液筛选整合有该质粒的细胞克隆.用荧光定量PCR、免疫荧光、Westrn blot、透射电镜等技术挑选稳定分泌HCV的单细胞克隆.结果 成功筛选到稳定分泌HCV的单细胞克隆,该细胞克隆能够有效产生HCV相关蛋白,上清液中HCV滴度达到1×107拷贝/ml,电子显微镜观察HCV直径为55 nm,上清液中病毒滴度随干扰素α浓度的升高而降低. 结论 利用核酶自剪切机制可建立稳定分泌HCV的细胞模型,该模型可用于抗HCV药物的筛选.
- 王盛安小平米志强刘大斌张宝中闾军周育森童贻刚
- 关键词：基因转染
- 基于XcmⅠ酶切的高效TA克隆载体的构建被引量：7
- 2008年
- 目的:制备基于XcmⅠ酶切的高效TA克隆载体,并检测其克隆PCR产物的效果。方法:设计一对互补配对的寡核苷酸,经过变性及退火后插入质粒pUC19的多克隆位点,从而在该多克隆位点中引入2个XcmⅠ酶切位点,用XcmⅠ酶切后即获得含有3'突出T碱基的T载体;为了提高该T载体的克隆效率,优化了2个XcmⅠ酶切位点之间的碱基数目,排除了载体自连产生白色克隆的可能性,使假阳性大大减少;此外,为了便于完全酶切与未完全酶切载体的分离,在2个XcmⅠ之间插入了一段无关DNA片段。结果:改进得到的T载体可以有效克隆PCR产物,其阳性克隆率可达95%。结论:构建了基于XcmⅠ酶切的TA克隆载体,经过改进的T载体具有很高的克隆效率。
- 顾頠张昕安小平陈锦辉刘大斌张宝中周育森童贻刚
- 关键词：T载体聚合酶链反应
- 抗人整合素αvβ3-组织因子融合蛋白基因的构建和表达被引量：1
- 2010年
- 目的:利用基因工程技术构建和表达抗人整合素αvβ3单链抗体(scFv)与人可溶性组织因子(sTF)的融合蛋白scFv-sTF。方法:用重叠延伸PCR技术扩增scFv基因,同时用组装PCR方法人工合成sTF基因,然后以酶切连接方式融合2个基因,并克隆至原核表达载体pQE80L中,构建表达质粒pQE80L-scFv-sTF,以重组子转化大肠杆菌M15诱导目的基因表达。结果:SDS-PAGE分析显示工程菌可以表达相对分子质量约55×103的融合蛋白scFv-sTF,Western印迹分析证实表达的目的蛋白具有6×His标签;经低剂量IPTG诱导和较低温度培养,scFv-sTF获得了可溶性表达;纯化回收目的蛋白,ELISA试验证实,该重组抗体分子具有良好的抗原结合活性。结论:构建并表达了抗人整合素αvβ3的单链抗体融合蛋白scFv-sTF,并验证了其抗原结合活性,初步证明它可以与抗原特异性结合,为进一步研究其抗肿瘤作用打下了基础。
- 刘大斌张昕安小平张宝中王盛周育森童贻刚
- 关键词：整合素ΑVΒ3单链抗体融合蛋白
- 基孔肯亚假病毒模型的建立及其在模拟检测中的应用
- 2010年
- 目的:构建含基孔肯亚病毒核酸序列的重组慢病毒载体,以之转染细胞以分泌含基孔肯亚病毒核酸序列的假病毒,利用该病毒建立基孔肯亚病毒的模拟检测方法。方法:人工合成基孔肯亚病毒部分保守性核酸序列,连入慢病毒载体,构建含基孔肯亚病毒核酸序列的重组慢病毒质粒pLenti-chik,该质粒连同辅助质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染293FT细胞;72 h后收集上清,用特异引物进行荧光定量RT-PCR检测。结果:建立了一个仅能进行一次复制、高度安全的基孔肯亚假病毒模型;同时采用荧光定量RT-PCR建立了较灵敏的检测病毒分泌的方法。结论:假病毒可以模拟基孔肯亚病毒分泌,但较真病毒安全性更高;用荧光定量的方法可以很灵敏地检测病毒的分泌,为突发基孔肯亚病毒感染的检测做好准备。
- 刘大斌张昕安小平张宝中王盛周育森童贻刚
- 关键词：基孔肯亚病毒假病毒实时荧光定量RT-PCR
- 表达萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型的建立被引量：1
- 2010年
- 目的:构建基于萤光素酶的单次复制人免疫缺陷病毒(HIV)细胞模型,用于抗HIV药物的筛选。方法:构建含萤光素酶报告基因的假型慢病毒质粒,将疱疹性口炎病毒外膜糖蛋白(VSV-G)的表达质粒、HIV-1 Rev蛋白表达质粒、HIV Gag-Pol蛋白表达质粒和含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒共转染HEK 293FT细胞,制备假型慢病毒;在假型慢病毒生产和再感染新鲜HEK 293FT细胞的过程中加入逆转录酶和蛋白酶抑制剂(如AZT),检测再感染的细胞中萤光素酶的表达水平,从而判断药物对HIV的抑制作用。结果:构建了含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc;利用已知抗HIV药物AZT进行测试,发现HIV药物处理组细胞中萤光素酶活性远低于对照组。结论:建立了基于萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型,该系统使用单次复制的报告病毒,具有良好的安全性,而使用萤光素酶基因作为报告基因使该系统具备极高的敏感性,该系统适合于进行高通量药物筛选。
- 张昕安小平陈斌张宝中王盛刘大斌童贻刚
- 关键词：人免疫缺陷病毒药物筛选
