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张剑: 作品数：12 被引量：5H指数：2; 供职机构：南京师范大学生命科学学院更多>>; 发文基金：江苏省自然科学基金国家自然科学基金江苏省“333工程”培养资金资助项目更多>>; 相关领域：医药卫生生物学环境科学与工程更多>>

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2型猪链球菌天冬氨酸激酶的原核表达及抗原性检测被引量：1: 2017年; 目的原核表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)并检测其免疫原性。方法对S.suis 2中国强毒株05ZYH33的AK编码基因05SSU1811进行生物信息学分析并设计引物,通过PCR从05ZYH33基因组中扩增目的片段。将目的基因克隆入原核表达载体pET28a,转化E.coli BL21(DE3)后采用IPTG诱导表达目的蛋白,用His亲和层析柱纯化重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的重组AK免疫BALB/c小鼠4次,采血,分离血清,采用间接ELISA检测抗体效价,并进行Western blot分析。结果构建的重组质粒在宿主菌中高效表达目的蛋白,His亲和层析柱纯化的重组蛋白,能与感染05ZYH33全菌的猪恢复期血清反应。ELISA检测重组AK免疫鼠血清抗体效价为1∶102 400,Western blot显示该抗血清能与重组蛋白反应。结论成功制备重组AK蛋白,该蛋白具有抗原性,为进一步研究AK在S.suis 2致病过程中的作用奠定了基础。; 孙卫平吴倩倩范伟伟张剑李超龙王长军潘秀珍高基民; 关键词：2型猪链球菌原核表达天冬氨酸激酶多克隆抗体

人β神经生长因子的克隆;高表达及生物学活性鉴定: 张剑; 关键词：神经生长因子基因表达细胞凋亡

2型猪链球菌DivIVA 蛋白调控细胞分裂及致病作用研究: 猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是重要人兽共患病病原菌,可使猪或人感染引发多种疾病.其中2型猪链球菌(S.suis2,SS2)致病性最强,可使人感染患脑膜炎、败血症、心内膜炎甚至中毒性休克综合征.病...; 倪华过雨晴杜世仁张剑范伟伟孙卫平王长军曹祥荣潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌致病作用细胞分裂蛋白调控

过表达AIF-1对A549细胞迁移的影响: AIF-1（allograft inflammatory factor-1,同种异体移植炎症因子-1）是一个17kDa、含Ca+结合EF-手形结构域,文献报道过表达AIF-1可以促进T淋巴细胞的增殖和迁移,利用siRNA...; 曹祥荣罗丽芸白敏张剑; 关键词：腺病毒载体增殖迁移; 文献传递

2型猪链球菌FtsZ重组蛋白的制备及其酶活性测定: 2017年; 目的制备2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)重组蛋白并测定其水解三磷酸鸟苷(GTP)的酶活性。方法从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中PCR扩增目的基因ftsz,构建重组表达质粒pET28a-ftsz,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,Ni 2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot分析。重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA法检测抗体效价,用孔雀绿-磷酸检测法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活性。结果成功构建pET28a-ftsz重组表达质粒;纯化获得大量纯度较高的FtsZ重组蛋白;ELISA检测兔多抗血清效价达1∶13 107 200;Western blot显示FtsZ重组蛋白能够与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应;以GTP为底物检测重组蛋白具有GTP酶活性。结论成功制备了具有GTP酶活性的2型猪链球菌FtsZ重组蛋白并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究2型猪链球菌FtsZ在细胞分裂调控过程中的作用奠定基础。; 范伟伟倪华孙卫平张剑李超龙吴倩倩王长军潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌纯化

2型猪链球菌stk/stp1基因敲除株的构建及特性研究: 2018年; 目的丝/苏氨酸激酶(STK)与丝/苏氨酸磷酸酶(STP)通过对蛋白质的可逆磷酸化调控原核生物的各项生理活动。文中旨在研究2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33中、stk/stp1同时缺失对其生物学特性及致病性的影响。方法运用同源重组的方法构建2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33的stk/stp1基因敲除突变株Δstk/stp1,比较分析野毒株05ZYH33与突变株Δstk/stp1的生物学特性;通过细胞黏附实验、抗吞噬实验以及小鼠感染模型分析stk/stp1缺失对细菌毒力的影响。将30只SPF级BALB/c小鼠,用随机数字表法分成05ZYH33组(注射1 m L野毒株菌液)、Δstk/stp1组(注射1 m L突变株菌液)和THB组(注射1 m L的新鲜THB液体培养基),每组10只。结果 PCR结果显示,stk/stp1基因被壮观霉素抗性基因Spcr替换,突变株构建成功;生物学特性实验表明,05ZYH33和Δstk/stp1在接种2 h后开始缓慢增殖,在7 h时都到达平台期。突变株进入对数生长期(A600≈0.4)的时间比野毒株推迟1 h左右,到达平台期后的菌体密度比野毒株低(0.8 vs 1.0)。05ZYH33和Δstk/stp1在血平板上均长出灰白色、圆形半透明、湿润、表面光滑的细小菌落。菌落周围有明显的β-溶血环,菌落形态和溶血活性无明显变化。小鼠致病性实验显示,05ZYH33组小鼠在12 h内全部死亡,Δstk/stp1组小鼠在12 h内死亡9只,24 h内全部死亡,THB组无发病和死亡症状。结论 stk/stp1同时缺失可能主要影响细菌增殖、分裂相关蛋白的调控。; 李超龙张剑吴倩倩侯红芬张会芳王长军曹祥荣潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌基因敲除生物学特性

2型猪链球菌细胞分裂蛋白DivIVA的原核表达及纯化被引量：3: 2016年; 目的利用原核表达系统制备2型猪链球菌细胞分裂起始因子DivIVA重组蛋白并进行纯化,为研究其在调控细胞分裂中的作用奠定基础。方法以2型猪链球菌05ZYH33全基因组为模板,PCR扩增divIVA基因片段,经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后将目的片段连接至表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a-divIVA,经测序鉴定后将重组质粒转化进入表达菌E.coli BL21,以终浓度为0.1mmol/L的IPTG于37℃培养4h,诱导DivIVA蛋白表达。用Ni离子亲和层析柱分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测和验证。结果成功构建重组表达质粒pET28a-divIVA,并在E.coli BL21中表达主要以包涵体形式存在的DivIVA蛋白。包涵体蛋白经8mol/L脲变性溶解后经Ni离子亲和层析柱纯化,获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测分子质量为36ku,与预期大小相符;经Western blot检测,该蛋白能被相应抗体特异性识别。结论在E.coli BL21中成功表达并纯化了DivIVA蛋白,为研究该蛋白在2型猪链球菌的细胞分裂机制奠定了基础。; 倪华过雨晴杜世仁张剑范伟伟孙卫平王长军曹祥荣潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌

2型猪链球菌细胞分裂蛋白DivIVA基因功能研究: 目的：通过构建2型猪链球菌(SS2)细胞分裂调控蛋白divIVA基因突变株△divIVA,研究该基因在调控细胞分裂及SS2致病性中的作用. 方法：构建中间携有壮观霉素(Spc)抗性,两端为divIVA基因同源臂...; 倪华过雨晴杜世仁张剑范伟伟孙卫平王长军曹祥荣潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌细胞分裂蛋白表达; 文献传递

hAIF-1基因重组腺病毒的构建及其对A549细胞增殖和迁移的影响: 2015年; h AIF-1是一种炎症因子,本研究通过构建h AIF-1基因的重组腺病毒,探讨h AIF-1对A549细胞增殖和迁移能力的影响.用PCR的方法克隆h AIF-1基因编码序列,并亚克隆到腺病毒穿梭质粒载体p DC315-EGFP上,构建穿梭质粒p DC315-EGFP-h AIF-1,将穿梭质粒与腺病毒骨架质粒p BHGloxdelta E13Cre共转染293细胞,利用Ad Max腺病毒载体包装系统包装腺病毒,TCID50法测定病毒滴度,利用RT-PCR和Western Blot分析检测目的基因表达,用MTT法检测A549细胞的增殖,细胞划痕和Transwell实验检测A549细胞的迁移.结果表明,成功构建了表达h AIF-1基因的重组腺病毒,所得病毒滴度为2.5×108pfu/m L;用h AIF-1重组腺病毒感染人A549细胞,RT-PCR和Western Blot鉴定显示细胞可过表达h AIF-1;MTT显示过表达h AIF-1可显著增强A549细胞增殖能力;细胞划痕和Tranwell实验证明h AIF-1能够促进A549细胞迁移.; 罗丽芸白敏张剑曹令森曹祥荣; 关键词：腺病毒增殖迁移

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达被引量：2: 1997年; 将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。; 张剑张锡然李朝军张林元柴建华; 关键词：基因表达大肠杆菌

张剑

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