朱甫祥
- 作品数：55 被引量：89H指数：6
- 供职机构：鲁东大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：山东省自然科学基金教育部留学回国人员科研启动基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生文化科学农业科学更多>>
- 缺氧再给氧对心肌细胞内游离钙浓度的影响被引量：6
- 2000年
- 朱甫祥刘炜王孝铭马丽英章顺国
- 关键词：心肌细胞缺氧再给氧游离钙浓度
- TMD2前断裂CFTR翻译后的连接及氯离子通道功能被引量：1
- 2010年
- CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化(CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因,旨在研究翻译后水平CFTR的连接,以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域(TMD2)前的Glu838密码子后将其cDNA断裂为N端和C端两部分,与具有蛋白质反式剪接作用的split Ssp DnaB intein编码序列融合,分别插入到载体pEGFP-N1和pEYFP-N1,构建一对真核表达载体pEGFP-NInt和pEYFP-IntC。用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞(BHK),瞬时表达实验用Western blotting观察CFTR蛋白质的连接,并用膜片钳技术记录Cl-通道电流。结果显示,基因共转染细胞呈现完整的CFTR蛋白条带,膜片钳记录到全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性。结果表明split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术可用于双载体共转移CFTR基因,为CF基因治疗应用双腺相关病毒载体(AAV)转运CFTR基因,克服AAV的容量限制提供了依据。
- 朱甫祥宫贤弟刘泽隆杨树德屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：CFTRSPLITSSPDNABINTEIN蛋白质反式剪接
- 前肽缺失vWF促进细胞分泌蛋白质剪接的L303E/F309S突变体凝血第八因子
- 2012年
- 该文旨在探索前肽缺失的von Willebrand因子(vWF-ΔPro)对蛋白质剪接的L303E/F309S突变体凝血第八因子(FVIII)分泌的影响。将vWF-ΔPro基因与蛋白内含子融合的FVIII重链和轻链基因共转HEK293细胞。结果显示,转vWF-ΔPro细胞的剪接蛋白FVIII分泌量和活性分别为(196±27)ng/mL和(1.39±0.31)IU/mL,明显高于对照细胞的(116±24)ng/mL和(0.91±0.18)IU/mL。表明vWF-ΔPro可提高剪接的L303E/F309S突变体FVIII蛋白分泌量和活性。
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：VWF蛋白质剪接分泌
- RNAi介导的Bip表达下调促进基于蛋白质剪接的双链共转基因细胞分泌FⅤⅢ凝血活性被引量：2
- 2012年
- 目的探讨用RNA干扰技术下调内质网蛋白伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的表达,对基于蛋白质剪接的双链共转凝血因子ⅤⅢ(FⅤⅢ)基因HEK293细胞分泌剪接FⅤⅢ蛋白的量和活性的影响。方法以培养的HEK293细胞,用含蛋白内含子的B区缺失型FⅤⅢ(BDD-FⅤⅢ)的重链和轻链基因表达载体共转染经Bip-siRNA处理的细胞,免疫印迹法检测Bip的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长,用酶联免疫吸附(ELISA)和发色分析法分析转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ蛋白量和活性。结果 RNA干扰下调Bip表达作用明显,细胞生长不受影响;Bip下调的共转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ和重链量分别为(142±33)μg/L和(197±43)μg/L,明显高于对照细胞[分别为(89±23)μg/L和(120±27)μg/L];Bip下调的共转基因细胞分泌的FⅤⅢ凝血活性为(1 050±160)IU/L,明显高于对照细胞[640±170(IU/L)]。结论 Bip表达下调通过促进剪接BDD-FⅤⅢ的分泌可有效提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅤⅢ基因功效,为进一步动物体内实验提供了依据。
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：蛋白质剪接
- 前肽缺失体vWF改善FVⅢ基因断裂转移细胞的重链和活性分泌被引量：1
- 2012年
- 通过转von Willebrand因子(vWF)的前肽缺失突变体(vWF-ΔPro)基因,探讨了vWF-ΔPro对双载体转凝血VⅢ因子(FVⅢ)基因的影响。将vWF-ΔPro基因和B-区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)的重、轻链基因共转染HEK293细胞48 h后,ELISA检测重链的分泌量为(142±29)ng/ml,明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(87±15)ng/ml;未转vWF-ΔPro基因时单独转重链基因的重链分泌水平很低,vWF-ΔPro存在时重链分泌量明显提高,但不如共转基因时的重链分泌,提示轻链可反式促进重链分泌;单独转轻链或与重链共转基因时轻链分泌水平均较高,且不受vWF-ΔPro影响;Coatest法检测分泌的凝血活性显示,转vWF-ΔPro基因可使细胞分泌的凝血活性明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(0.80±0.15 IU/ml vs 0.41±0.08 IU/ml)。另外,转vWF-ΔPro基因条件下,合并培养转重链和转轻链基因细胞的培养上清中,也检测到FVIII凝血活性(0.23±0.09IU/ml),提示vWF-ΔPro有助于分泌的重、轻链形成功能性异源二聚体。表明转vWF-ΔPro基因可促进双链转FVⅢ基因,为进一步动物体内实验奠定了基础。
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：WILLEBRAND因子
- 大肠杆菌BL21(DE3)中DnaE intein介导ABCA1蛋白的连接
- 2009年
- 【目的】利用SspDnaEintein的蛋白质反式剪接技术研究在大肠杆菌中对ABCA1基因表达产物的连接作用。【方法】将ABCA1的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys978密码子前断裂为N端和C端两部分,分别与天然存在的反式作用SspDnaEintein的123个氨基酸的N端和36个氨基酸的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)。转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,诱导表达后观察重组蛋白的表达和ABCA1的连接。【结果】转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示预期大小的ABCA1剪接蛋白条带,并进一步为His-Tag抗体进行的Western blotting证实。【结论】结果表明SspDnaEintein可有效催化ABCA1的连接,为进一步研究利用双腺相关病毒(AAV)载体转运ABCA1基因,克服单个AAV载体容量限制进行由ABCA1基因突变所致Tangier病的基因治疗奠定了基础。
- 朱甫祥缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：INTEIN蛋白质反式剪接ABCA1
- 双载体断裂CFTR基因转移及翻译后的连接和功能被引量：3
- 2010年
- 囊性纤维化跨膜电导调节体(CFTR)基因突变导致一种常染色体隐性遗传病囊性纤维化(CF),利用腺辅助病毒(AAV)载体转运CFTR基因的基因疗法受到AAV载体容量的限制。本文采用intein的蛋白质反式剪接技术,以双载体转运CFTR基因,研究了于其调节结构域(R)断裂成两部分的CFTR基因翻译后的连接及其产生的Cl-通道功能。将人CFTRcDNA于R结构域的Ser712密码子前断裂,构建一对融合SspDna Bintein编码序列的真核表达载体。将这对载体共转染培养的幼年仓鼠肾(BHK)细胞,通过瞬时表达,全细胞和单通道膜片钳记录Cl-电流,并用Westernblotting观察CFTR蛋白的剪接。结果表明,共转染细胞显示较高的全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性,说明CFTR的Cl-通道功能的恢复,用CFTR特异性抗体进行的细胞总蛋白Westernblotting显示有完整的CFTR蛋白条带形成,表明intein可有效连接翻译后的两部分CFTR蛋白。结果提示,蛋白质剪接技术可有效用于双载体系统转运CFTR基因,为进一步应用双AAV载体转运CFTR基因的CF基因治疗研究提供了实验依据。
- 朱甫祥刘泽隆屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：蛋白质反式剪接氯离子通道
- 糖基化修饰促进内含肽剪接的凝血因子Ⅷ的分泌和活性被引量：3
- 2010年
- 目的 观察糖基化修饰对内含肽剪接的B区缺失型凝血因子Ⅷ（BDD-FⅧ）分泌的影响.方法 将含有6个潜在的天冬酰胺糖基化位点（N6）的FⅧ的B区226个氨基酸引入BDD-FⅧ重链,用双载体转融合内含肽的此重链和轻链基因（N6HCIntN和IntCLC）至培养的293细胞,用酶联免疫吸附试验（ELISA）和Coatest发色法分别检测基因共转染细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和凝血生物活性.结果 共转染N6HCIntN和IntCLC基因细胞上清中BDD-FⅧ蛋白浓度为（123±18）ng/ml,凝血活性为（0.94±0.11）U/ml,明显高于共转染内含肽融合的无糖基化修饰重链（HCIntN）和IntCLC基因细胞上清的BDD-FⅧ蛋白浓度[（86±12）ng/ml]和凝血活性[（0.65±0.07）U/ml,均P＜0.05].分别转染N6HCIntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和凝血活性[（18±6）ng/ml,（0.15±0.05）U/ml].结论 糖基化修饰可促进内含肽剪接的BDD-FⅧ的分泌并表现出不依赖细胞机制的蛋白质剪接功能.
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：糖基化蛋白质剪接内含肽
- “渗透性”生物化学双语教学模式改革与探索被引量：3
- 2012年
- 生命科学迅猛发展,新知识不断涌现,学科交叉在生命科学研究中日益显示其强大活力。生物化学对于生命科学的发展起着重要的引领作用,突出地表现在其具有生命科学基本语言的功能。因此,生物化学教学在生命科学教学中具有重要地位,肩负着创新型人才培养的重任。"渗透性"教学旨在激发学生对生命科学的兴趣,唤起和发挥学生在教学中的主体意识和作用,采用双语教学形式,将生化知识融汇于鲜活而丰富多彩的生命现象,注重知识的生命性、应用性、前沿性、交叉性以及蕴藏于生化知识的科学思想的教学,培养学生的科学思维能力,提高学生摄取新知识的意识和能力。
- 朱甫祥
- 关键词：生物化学教学改革
- 基于高素质应用型人才培养的生物化学教学被引量：8
- 2012年
- 生物技术专业肩负着高素质应用型人才培养的重任。作为本专业最重要的专业基础课程,同时也是生命科学的共同语言,生物化学致力于分子水平理解生命现象的本质,是生命科学转化为生物技术的基础和支撑。因此,生物化学教学在以应用型人才培养为主要使命的生物技术专业建设和发展中突显其重要性。在生物化学教学中,我们积极探索教学改革,坚持以人为本、与时俱进,用科学发展观统领教学,突出基础知识体系进行形象化教学、开展互动式和讨论式教学,变学生的被动上课为主动听课,引入生命科学的前沿知识,进行双语教学,注重实验课教学和科研训练,培养学生的科学思维和应用知识的能力,关心学生成长,教书育人。
- 朱甫祥
- 关键词：生物技术高素质应用型人才生物化学教学改革
