陈攀
- 作品数：6 被引量：17H指数：3
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- 猪流行性腹泻病毒M和S蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：3
- 2014年
- 采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白基因的亲水区进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆至原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。表达产物经SDS-PAGE后切胶免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价,Westernblot和间接免疫荧光方法检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达,且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLP)抗原和建立血清学检测方法奠定基础。
- 郑芳园陈攀范宝超李玉峰
- 关键词：猪流行性腹泻病毒M蛋白S蛋白原核表达多克隆抗体
- PRRSV GP5糖基化位点对VLPs形成的影响及免疫原性分析
- 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病，以妊娠母猪繁殖障碍及新生仔猪...
- 陈攀
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒免疫原性
- 猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达和纯化
- 2014年
- 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)是一种具有多种生物学活性的细胞因子。本试验根据GenBank发表的猪的GM-CSF基因序列设计特异性引物,对GM-CSF基因片段进行扩增,扩增后的PCR产物经酶切后克隆入pET-28a载体。重组质粒转化入大肠杆菌杆菌BL21中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果证明,重组蛋白获得了成功表达,并且主要以包涵体的形式存在。Western blot结果证明重组蛋白具有良好免疫反应性。以上结果为进一步应用重组GM-CSF作为血液干细胞动员剂提供了基础。
- 张亚宁赵红英陈攀郑芳园李玉峰
- 关键词：重组蛋白原核表达
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒截短GP5蛋白间接ELISA方法的建立被引量：3
- 2014年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状,目前尚无有效的血清学检测方法评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系。为建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法,本研究选择GP5蛋白亲水区进行原核表达,以表达的重组蛋白tGP5为包被抗原建立了检测针对GP5蛋白抗体的ELISA方法,优化后反应条件为:抗原包被浓度2μg/mL,37℃包被2 h,5%脱脂乳37℃封闭2 h,待检血清稀释度1∶100,37℃作用1 h,二抗1∶20 000稀释,37℃作用45 min,37℃显色3 min,抗体临界值OD450nm≥0.22判为阳性,OD450nm<0.183判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。
- 陈攀郑芳园李玉峰
- 关键词：PRRSV间接ELISA
- 汉赛巴尔通体17-kDa蛋白的表达及间接ELISA方法的建立被引量：2
- 2013年
- 为探讨中国猪群中是否存在巴尔通体感染情况,作者将汉赛巴尔通体17-kDa蛋白基因按大肠杆菌密码子偏嗜性改造后进行全基因人工合成,然后将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-17kDa,导入大肠杆菌BL21感受态细胞中,进行诱导表达,并用Ni-NTA纯化试剂进行纯化;纯化后的蛋白应用His单抗进行鉴定。以17-kDa蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立检测抗汉赛巴尔通体17-kDa蛋白抗体的间接ELISA方法。结果如下:抗原包被量0.4μg·mL-1,37℃包被2h后4℃过夜,1%BSA 37℃封闭3h,待检血清1∶100稀释后,37℃孵育1h,二抗1∶15 000稀释,37℃作用30min,抗体临界值OD450nm≥0.392判为阳性,OD450nm≤0.332 6判为阴性,介于二者之间为可疑。建立的ELISA与猪嗜血支原体、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪口蹄疫病毒等感染血清无交叉反应,批间和批内重复性较好,对379份血清样品进行检测,抗体阳性检出率达51.72%。该方法可用于汉赛巴尔通体抗体检测和流行病学调查。
- 程王琨常晨马培培陈攀郑芳园李玉峰
- 关键词：巴尔通体间接ELISA
- 副猪嗜血杆菌不同血清型稳定表达蛋白的筛选及间接ELISA检测方法的建立被引量：9
- 2015年
- 为了建立一种能够检测不同血清型副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA,选用了在4、5、12型副猪嗜血杆菌中稳定表达的3种蛋白经原核表达后作为候选抗原和全菌裂解物同时包被酶标板,对临床猪血清进行副猪嗜血杆菌抗体检测,发现以锰依赖的超氧化物歧化酶(MSD)作为包被抗原得到的结果最接近用副猪嗜血杆菌全菌裂解物进行ELISA检测的结果,故确定以MSD蛋白为抗原建立间接ELISA。通过方阵滴定对ELISA反应条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:包被抗原的质量浓度为1.5μg/mL,4℃过夜;50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭2h;血清稀释度1∶160,37℃作用90min;酶标二抗的稀释度为1∶15 000,37℃作用45min;底物显色时间为37℃6min。抗体临界值D450nm≥0.245 1判为阳性,D450nm<0.208 3判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、红斑丹毒丝菌、马链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。用建立的间接ELISA对114份临床血清进行检测,与4、5、12型全菌裂解物的ELISA检测结果比较,阳性符合率分别为80.77%、80.00%和90.00%。结果表明,建立的间接ELISA可被用于4、5、12型副猪嗜血杆菌的抗体检测和流行病学调查。
- 朱晓明邹垚陈攀王丽敏李玉峰
- 关键词：副猪嗜血杆菌间接ELISA
