刘阳剑
- 作品数：6 被引量：25H指数：4
- 供职机构：中国科学院微生物研究所更多>>
- 发文基金：中国科学院重点实验室基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学化学工程更多>>
- 钝齿棒杆菌天冬氨酸激酶基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及表达的研究
- 该文运用PCR方法从野生型钝齿棒杆菌株（Corynebacterium crenatum AS 1.542）及具有S-氨乙基半胱氨酸（AEC）抗性的突变株（Corynebacterium crenatum CD945）染...
- 刘阳剑
- 关键词：钝齿棒杆菌赖氨酸天冬氨酸激酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因克隆
- 文献传递
- 钝齿棒杆菌天冬氨酸激酶基因的克隆和序列分析被引量：4
- 2002年
- 运用PCR方法 ,从野生型钝齿棒杆菌株 (Corynebacteriumcrenatum)AS1 5 4 2及具有AEC抗性的突变株CD945染色体上分别扩增出天冬氨酸激酶 (AK)基因 (ask) ,构建了重组质粒。核苷酸序列分析表明 ,C .crenatumAS1 5 4 2AK基因与C .crenatumCD945相比 ,第 1 1 99位的碱基由T变为C ,引起酶蛋白β亚基第 80位氨基酸从亮氨酸变成脯氨酸。该氨基酸的突变在蛋白结构上位于ACT结构域内 ,该区受赖氨酸调控。C .crenatumAS1 5 4 2的AK基因的编码区核苷酸序列与C .glutamicum、C .flavum及B .lactofermentum相比 ,同源性分别为 97 2 3 %、97 5 5 %和 97 6 2 % ,酶蛋白氨基酸序列的同源性分别为 99 76 %、99 5 2 %和 99 76 %。但在AK基因的启动子上游序列部分与其它棒杆菌相比有较大差异。
- 刘阳剑张英姿王绛王宇余志华丁久元
- 关键词：钝齿棒杆菌克隆赖氨酸
- 抗反馈抑制的天冬氨酸激酶基因在钝齿棒杆菌中的表达被引量：6
- 2005年
- 将来自钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)CD945具有AEC抗性的天冬氨酸激酶(AKfbr)基因克隆到穿梭载体pJC1上,构建重组质粒pLY153。用电击法将质粒pLY153转化到野生型菌株C.crenatumAS1.542及其突变株C.crenatumCD945中。携带AKfbr基因的C.crenatumAS1.542菌株能抗浓度皆为12mgmL的AEC和苏氨酸。AKfbr基因在C.crenatumCD945中得到表达,天冬氨酸激酶活性提高4倍。摇瓶发酵实验结果表明,重组菌在对数前期和中期生长正常,不受抑制;与对照菌相比,赖氨酸终产量提高22%,赖氨酸生产率提高23%。
- 赵智刘阳剑王宇张英姿丁久元曹芹郝宁
- 真养产碱杆菌112R_4酰亚胺酶基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达被引量：10
- 2002年
- 筛选到一株具海因水解活力的微生物 ,经鉴定后命名为真养产碱杆菌 1 1 2R4 。该菌能水解海因、二氢尿嘧啶和琥珀酰亚胺 ,且对琥珀酰亚胺活力最高 ,但不水解 5 单取代海因和5 ,5’ 双取代海因 ,因而被确定为含有酰亚胺酶。真养产碱杆菌 1 1 2R4 能在以琥珀酰亚胺为唯一碳、氮源的培养基上生长 ,表明该菌中存在琥珀酰亚胺完整的转化途径。从 1 1 2R4 基因组DNA出发 ,用鸟枪法克隆了一个 6kb的与环酰亚胺水解相关的DNA片段 ;进一步亚克隆得到了带酰亚胺酶基因的 2kb的DNA片段 ,并进行了序列测定。缺失分析确定了一个 876bp的ORF为真养产碱杆菌 1 1 2R4 的酰亚胺酶基因 ,推测编码一个 2 91个氨基酸的多肽 ,这是第一次报道微生物酰亚胺酶的核酸和蛋白序列。推测的氨基酸序列在蛋白数据库中进行了比较 ,结果表明 ,酰亚胺酶与已知的环酰胺酶没有明显的同源性 ,也不属于氨酰水解酶蛋白超家族 ,因而被分类为一种新的环酰胺酶。真养产碱杆菌 1 1 2R4 的酰亚胺酶与芽生杆菌A1 7p 4的酰亚胺酶N端的 2 0个氨基酸有较高的同源性 ,一致性为 6 0 % ,与多糖脱乙酰酶保守序列也部分同源 ,一致性为 1 4%。带有酰亚胺酶基因的重组质粒在大肠杆菌中得到表达 ,在lac启动子控制下 ,使用 1mmol LIPTG诱导 5h 。
- 王宇张英姿丁久元刘阳剑王绛余志华
- 关键词：基因克隆基因表达真养产碱杆菌
- 钝齿棒杆菌CD945丙酮酸羧化酶基因的克隆、序列分析及表达被引量：5
- 2003年
- 以钝齿棒杆菌 (Corynebacteriumcrenatum)突变株CD945的基因组为模板 ,运用PCR方法 ,扩增出丙酮酸羧化酶的基因片段。核苷酸序列分析结果表明 ,该片段全长 365 7bp ,以GTG为起始密码子 ,编码一个ORF。该ORF的核酸序列与Corynebacteriumglutamicum ,Mycobacteri umsmegmatis以及Saccharomycescerevisiae的丙酮酸羧化酶结构基因相比 ,相似性分别为98 2 2 %、62 41 %和 49 61 %。由ORF推导出的氨基酸序列与上述属种的丙酮酸羧化酶相比 ,同源性分别是 99 30 %、64 65 %和 44 0 4 %。经证实对于酶的催化活性至关重要的一些保守区域 ,如ATP和生物素的结合位点等 ,在该氨基酸序列中都存在。将该基因片段转化钝齿棒杆菌 (C .crenatum)CD945 ,利用CTAB处理细胞和苹果酸脱氢酶偶联测定相结合的方法 ,进行酶活力的分析 ,结果表明 ,重组子与供体菌相比 ,丙酮酸羧化酶的活力提高
- 王绛刘阳剑王宇张英姿余志华丁久元
- 关键词：棒杆菌丙酮酸羧化酶氨基酸基因
- 真养产碱杆菌112R_4的二羧酸单酰胺酰胺水解酶被引量：2
- 2003年
- 在一株具有环酰亚胺转化活性的真养产碱杆菌 1 1 2R4 中发现了一种特异性的二羧酸单酰胺酰胺水解酶 (半酰胺酶 ) ,它催化环酰亚胺代谢的第二步反应 ,将二羧酸单酰胺水解为二羧酸和氨。该酶的底物仅限于此代谢途径的第一个酶———酰亚胺酶的产物二羧酸单酰胺 ,而对其它的酰胺类化合物没有明显水解活性。真养产碱杆菌 1 1 2R4 中的半酰胺酶和酰亚胺酶在表达上具有相关性 ,环酰亚胺 (如琥珀酰亚胺 )和二羧酸单酰胺 (如琥珀酰胺酸 )对它们有正调控作用 ,游离氨离子显示出负调控作用 ,琥珀酸则在酶合成和活性两方面均表现出影响作用。对重组大肠杆菌中表达的半酰胺酶粗酶的部分性质进行了研究。钴离子对半酰胺酶的活性表现出促进作用 ,比活力提高到 3.37倍 ,表明半酰胺酶可能是一种金属结合酶。
- 张英姿王宇余志华刘阳剑王绛丁久元
