张考
- 作品数：15 被引量：30H指数：4
- 供职机构：燕山大学环境与化学工程学院更多>>
- 发文基金：河北省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 人CD14信号肽介导卵清蛋白在HEK293T细胞的高效表达
- 2012年
- 本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5'端与人CD14信号肽序列融合和非融合的OVA基因,并将它们分别插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成表达载体pcDNA-CD14sp-OVA和pcDNA-OVA。经磷酸钙介导,将质粒转染至HEK293T细胞,使其进行表达,用鼠抗OVA单克隆抗体通过免疫印迹(Western blot)法检测OVA表达水平。结果表明:本试验扩增的OVA基因序列与GenBank中的序列(登录号NM_205152)一致,构建的人CD14信号肽序列融合OVA基因的表达载体结构正确。经过在HEK293T细胞的表达,融合人CD14信号肽序列的重组蛋白OVA的表达水平明显得到提高。结果提示,融合人CD14信号肽序列后的重组蛋白OVA在非输卵管上皮细胞中的表达水平明显提高,为OVA基因作为DNA疫苗模式抗原的应用提供了必要的条件。
- 能昌爱李秀锦仲飞李振张峰陈慧慧张考韩冬梅
- 关键词：卵清蛋白重组蛋白表达
- 重组猪肺表面活性蛋白A在体外可抑制PRRSV感染宿主细胞
- 2012年
- 表面活性蛋白A(SP-A)是动物肺泡表面重要的天然防御物质。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的宿主细胞是猪肺泡巨噬细胞(PAM),SP-A是否对PRRSV的感染有影响尚不清楚。为此本文通过制备重组SP-A在体外分析了SP-A对PRRSV感染的影响。首先采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因。
- 张峰仲飞李秀锦王幸兴张考陈慧慧李振李文艳潘红丽韩冬梅
- 关键词：宿主细胞PRRSV感染肺表面活性蛋白肺泡巨噬细胞信号肽序列分泌型表达载体
- 含绿色荧光蛋白基因的PRRSV感染性克隆的制备及特性分析
- 为直观形象地观察PRRSV对细胞的感染,本文拟构建含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,并对其某些特性进行分析。首先依据PRRSV病毒株(GenBank:AY545985.1...
- 张考仲飞李秀锦陈慧慧李文艳温洁霞
- 文献传递
- 含绿色荧光蛋白基因的PRRSV感染性克隆的制备及特性分析
- 2012年
- 为直观形象地观察PRRSV对细胞的感染,本文拟构建含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,并对其某些特性进行分析。首先依据PRRSV病毒株(GenBank:AY545985.1)的序列,以其感染性克隆重组质粒(FL-12)和含有GFP基因的质粒(PCDNA-EF1-GFP)为模板,采用重叠PCR的方法,扩增出上。
- 张考仲飞李秀锦陈慧慧李文艳温洁霞
- 关键词：感染性克隆PRRSV感染病毒株非结构蛋白体外转录
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒通过囊膜蛋白E激活猪肺泡巨噬细胞炎性体
- 猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是PRRS病毒(PRRSV)引起的以繁殖障碍和呼吸系统疾病为特征的一种急性传染病，是目前危害养猪业发展的最...
- 张考
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒白细胞介素1Β致病机制
- 重组猪肺表面活性蛋白A在体外可抑制PRRSV感染宿主细胞被引量：8
- 2012年
- 【目的】研究重组猪肺表面活性蛋白A(SP-A)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的抑制作用。【方法】采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因,并将其插入到含有人CD5信号肽序列的真核表达载体pcDNA3.1A-CD5中,构建成SP-A基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5-SPA/MH。将重组表达载体通过磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western blot方法鉴定表达产物,采用Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中分离和纯化重组SP-A蛋白,通过ELISA方法检测SP-A蛋白与PRRSV的结合活性。将SP-A蛋白与PRRSV孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,感染72 h后测定病毒滴度,分析重组SP-A蛋白对PRRSV感染的抑制作用。【结果】结果表明构建的真核表达载体能够介导SP-A基因在HEK293T细胞中进行分泌表达;表达的重组猪SP-A蛋白能够与PRRSV进行剂量依赖性结合;用重组猪SP-A蛋白与PRRSV进行孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,结果显示SP-A处理的PRRSV感染细胞后的病变程度明显低于对照组。感染72 h后,SP-A处理组的PRRSV在MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞的滴度明显低于SP-A非处理组。【结论】重组猪SP-A在体外对PRRSV的感染有明显的抑制作用,揭示SP-A具有抗PRRSV的活性。
- 张峰仲飞李秀锦王幸兴张考陈慧慧李振李文艳潘红丽韩冬梅
- 关键词：抗病毒活性猪繁殖与呼吸综合征病毒真核表达
- PRRSV囊膜GP5/M双基因表达载体的构建
- 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害养猪业发展最严重的传染病之一,目前由于缺乏有效的疫苗未能得到有效控制。已知PRRS病毒(PRRSV)主要感染猪的肺泡巨噬细胞(PAM),我们在研究猪天然防御活性物质时发现,肺泡表面活性...
- 陈慧慧王利月林洪羽王永红张考李文艳温洁霞仲飞李秀锦
- 犬细小病毒NS1非结构蛋白可诱导细胞凋亡被引量：8
- 2012年
- 【目的】研究犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)非结构蛋白NS1在CPV引起宿主细胞凋亡中的作用,初步探讨CPV引起细胞凋亡的机制。【方法】首先采用PCR方法从犬细小病毒基因组中扩增NS1编码基因,然后利用pcDNA3.1A质粒构建NS1真核表达载体pcDNA-NS1,并通过HEK293FT细胞瞬时表达NS1重组蛋白,用Western-blot检测以确定重组NS1蛋白能否在真核细胞中表达。然后用CPV感染和用pcDNA-NS1表达载体转染F81宿主细胞,通过AnnexinV/PI双染法检测磷脂酰丝氨酸外翻和通过化学发光法检测caspase-3/7活性,分析感染CPV或转染NS1基因对F81宿主细胞凋亡的影响。【结果】结果表明,本实验扩增的NS1基因序列与GenBank的序列一致,构建的表达载体结构正确,并能够介导NS1基因在真核细胞中表达。感染CPV和转染NS1基因均能诱导F81细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和明显提高细胞内caspase-3/7的活性,表明CPV和NS1蛋白均能引起细胞的凋亡。【结论】CPV诱导宿主细胞凋亡与其编码的NS1非结构蛋白有关。
- 潘红丽仲飞潘素敏李秀锦张峰张考陈慧慧
- 关键词：犬细小病毒NS1蛋白细胞凋亡
- 慢病毒载体介导猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白在猪肺泡巨噬细胞中的表达
- 2012年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)E蛋白是病毒最小的囊膜蛋白,与其它囊膜糖蛋白(GP2a、GP3、GP4)以复合物的形式存在于囊膜中。研究认为E蛋白是一种粒子孔道蛋白,推测与病毒释放和致病过程有关。为研究E蛋白的致病作用,需将E蛋白基因转入猪肺泡巨噬细胞内并使其表达。为此本文利用慢病毒载体将PRRSV的E基因转入巨噬细胞。
- 陈慧慧仲飞李秀锦张考李文艳温洁霞
- 关键词：囊膜糖蛋白基因转入慢病毒载体病毒载体介导致病过程
- 重组猪IL-7在真核细胞的分泌表达及生物活性分析被引量：1
- 2013年
- 为了解猪IL-7(pIL-7)在防治猪免疫抑制性传染病及疫苗生物佐剂中的作用,通过RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出含有自身信号肽序列的pIL-7 cDNA基因,将其克隆到pcDNA3.1A表达载体上,构建出羧基端与Myc/His融合的pIL-7基因真核表达载体pcDNA3.1A-pIL-7/MH。由磷酸钙介导将pcDNA3.1A-pIL-7/MH质粒转染人类胚胎肾细胞293T(HEK293T)使其进行瞬时表达,以Western-blot检测构建的pIL-7基因表达载体是否可介导重组pIL-7在真核细胞中进行分泌型表达。然后利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化表达的重组pIL-7,并通过淋巴细胞增殖试验检测其的生物活性。结果表明,扩增的pIL-7基因序列与GenBank序列完全一致;构建的表达载体可介导重组pIL-7在真核细胞HEK293T中进行分泌型表达。表达的重组pIL-7对猪脾淋巴细胞有明显的促增殖效应。由此可见,利用真核细胞表达的重组pIL-7具有生物活性。
- 温洁霞林洪羽王利月李文艳张考陈慧慧仲飞李秀锦
- 关键词：真核表达
