王同坤
- 作品数：9 被引量：57H指数：4
- 供职机构：军事医学科学院疾病预防控制所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划长江学者和创新团队发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 利用自杀载体构建布鲁氏菌hfq表位标记菌株被引量：1
- 2012年
- 目的:建立一种利用自杀载体构建布鲁氏菌hfq表位标记菌株的方法。方法:在hfq的反向引物带上FLAG或HIS标签序列,以布鲁氏菌Brucella melitensis 16M为模板扩增出3'端带有标签的hfq标记盒。将其直接与布鲁氏菌的自杀载体pMD18-T vector连接,获得带有标签的标记载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得表位标签与目的基因C末端融合的重组子。利用RT-PCR和Western blot分析C末端融合了表位标签的目的蛋白的转录和表达的情况。结果:获得了布鲁氏菌的表位标记菌株16M-T-HfqFLAG和16M-T-HfqHIS。RT-PCR实验结果表明带有标签的hfq基因可以转录,Western blot实验结果证实利用针对FLAG或HIS标签的抗体能够检测到Hfq蛋白的表达。结论:利用自杀载体可以快速构建布鲁氏菌的表位标记菌株,这不仅为Hfq的功能研究奠定了基础,也为布鲁氏菌的基因功能研究提供了一个有价值的研究手段。
- 崔明全徐杰张婷婷王同坤尚伟陈泽良袁静杜昕颖汪舟佳柯跃华钟志军苑锡铜黄留玉彭广能王玉飞
- 关键词：布鲁氏菌HFQ
- 布鲁菌进化和分类学研究进展被引量：21
- 2011年
- 布鲁菌属革兰氏阴性兼性胞内寄生菌,能感染多种宿主动物和人。该属可分为6个典型种,包括羊种、牛种、猪种、沙林鼠种、绵羊附睾种以及犬种布鲁菌等。此分类是基于其致病性以及宿主偏好性的差异划分。尽管6个种通过传统表型试验能区分,但布鲁菌种内采用DNA-DNA杂交证明DNA同源性高度一致(相似性大于90%)。因此有人提议布鲁菌由单一种组成,即布鲁菌属中只有羊种布鲁菌,其他种都是羊种菌的生物亚型之一。然而基于其他分子技术的基因分型表明其DNA多态性表现明显,说明目前对这个种的分型还是比较准确。而最近分离的海洋种布鲁氏菌分离株(鳍型和鲸型)采用传统分型标准和一些特异的分子标记也证明这种分型比较正确。本文对目前布鲁菌种属进化和分类学进行综述,希望对研究其进化和分类有所帮助。
- 钟志军于爽徐杰王玉飞白耀霞陈燕芬付思美王同坤汪舟佳杜昕颖彭广能黄克和陈泽良
- 关键词：布鲁氏菌进化分类学
- 布鲁杆菌Cu-Zn SOD和GroEL的克隆表达及细胞免疫特性比较分析被引量：3
- 2010年
- 目的分析比较布鲁杆菌两种外膜蛋白Cu-Zn SOD和GroEL的细胞免疫特性。方法以布鲁杆菌16M基因组为模板,PCR扩增Cu-Zn SOD和GroEL蛋白的基因序列。采用Gateway方法构建表达载体,在大肠埃希菌中诱导表达并纯化,用获得的纯化蛋白刺激减毒活疫苗S19免疫小鼠的脾细胞,并测定细胞上清中IFN-γ的水平。结果成功克隆表达了Cu-Zn SOD和GroEL蛋白,用这两种蛋白刺激S19免疫小鼠脾细胞后,细胞上清中的IFN-γ水平明显升高,并且GroEL刺激后的IFN-γ水平高于Cu-Zn SOD刺激后的IFN-γ水平。结论 GroEL和Cu-Zn SOD蛋白均具有细胞免疫反应特性,且GroEL的细胞免疫反应特性强于Cu-ZnSOD。
- 于爽徐杰付思美王玉飞白耀霞钟志军陈燕芬王同坤杨毅杜昕颖汪舟佳李竞黄留玉陈泽良
- 关键词：GATEWAY技术
- 布鲁氏菌vjbR突变株的构建及其毒力表型分析被引量：4
- 2010年
- 为分析vjbR在布鲁氏菌毒力中的作用,构建了vjbR的突变株和互补株,并分析了它们在巨噬细胞和小鼠体内的存活能力。利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了16M的vjbR(BMEII1116)基因,得到了vjbR的缺失突变株16M△vjbR。将vjbR基因的ORF克隆到pMD18-T载体中,然后将其转入到突变株16M△vjbR中得到互补株16M△vjbR-C。用16M、16M△vjbR和16M△vjbR-C侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析它们在巨噬细胞内的生存能力及小鼠毒力。研究结果表明vjbR突变株在巨噬细胞和小鼠体内的毒力减弱,存活能力下降,说明vjbR基因是布鲁氏菌16M的毒力相关基因,对于布鲁氏菌建立慢性感染是必要的。
- 付思美白耀霞曲勍徐杰王玉飞钟志军于爽王同坤杨毅陈燕芬汪舟佳杜昕颖黄留玉甄清陈泽良
- 关键词：布鲁氏菌毒力
- 布鲁氏菌比较基因组学研究进展被引量：14
- 2011年
- 依据宿主偏好性的不同,布鲁氏菌分为6个经典种。根据生物学特性又将其分为19个亚型。包括：B.melitensis（羊种,主要感染绵羊和山羊种,
- 钟志军于爽徐杰王玉飞彭广能陈燕芬白耀霞付思美王同坤汪舟佳杜昕颖黄克和陈泽良
- 关键词：布鲁氏菌比较基因组学生物学特性羊种
- 利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌缺失突变株被引量：17
- 2010年
- 目的:建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率。方法:采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得布鲁氏菌的缺失突变株。结果:结合融合PCR和T载体快速克隆,能够在48h之内构建好突变载体,与传统的酶切连接相比,效率高、周期短。结论:基于T载体快速克隆是一种非常高效的构建突变株的方法,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一种新方法。
- 白耀霞杨毅王玉飞王同坤于爽陈燕芬付思美黄留玉田晋红陈泽良
- 关键词：布鲁氏菌T载体
- 布鲁氏菌全基因组DNA芯片研制及比较基因组杂交方法的建立被引量：4
- 2011年
- 为利用布鲁氏菌强毒株马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)16M和流产布鲁氏菌(B.abortus)9-941全基因组序列,构建布鲁氏菌全基因组DNA芯片,并将其应用于比较基因组学分析,从基因库下载马耳他布鲁氏菌16M和流产布鲁氏菌9-941中的3 218个基因设计引物,经过条件优化和重新设计引物等方法进行大规模PCR扩增,成功扩增3 212条基因。产物纯化后点制醛基修饰玻片,每个基因2个点,加上阳性和阴性对照,芯片上合计6 912个探针。囊括了布鲁氏菌3 212条基因和阳性、阴性对照点。采用Cy3/Cy5双色荧光杂交技术,分别以马耳他布鲁氏菌16M和流产布鲁氏菌9-941作为参照和待测样本进行荧光双色杂交分析,成功建立了布鲁氏菌比较基因组杂交分析方法。若干质控杂交结果表明,建立的全基因组DNA芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。证明成功建立了基于全基因组DNA芯片的布鲁氏菌比较基因组学技术平台。
- 钟志军徐杰于爽王玉飞周冬生汪舟佳杜昕颖白耀霞陈燕芬付思美王同坤黄克和陈泽良彭广能
- 关键词：布鲁氏菌DNA芯片比较基因组学
- 羊布鲁氏菌非编码小RNA分子BSR-2的预测与鉴定被引量：2
- 2010年
- 利用RT-PCR和RACE等方法对生物信息学预测的羊布鲁氏菌非编码小RNA(smallnon-codingRNA,sRNA)BSR-2进行了实验鉴定,并通过分析BSR-2在胞内生存缺陷株中的转录情况以及预测BSR-2的靶标基因对BSR-2的功能进行初步探讨.RT-PCR结果表明,BSR-2在羊布鲁氏菌的总RNA中存在转录本,而且在不同的应激条件下转录水平不同.RACE结果表明,BSR-2长224nt,位于Ⅱ号染色体的BMEII0742和BMEII0743之间的基因间区.进一步的实验结果表明,BSR-2可能与布鲁氏菌的胞内生存能力相关.
- 王同坤王立贵陈泽良杜昕颖汪舟佳黄留玉刘波王玉飞
- 关键词：布鲁氏菌靶基因
- 布鲁氏菌非编码小RNA的预测、鉴定及BSR-16的功能分析
- 布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病,在世界各地都有广泛流行。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,主要寄生于机体的单核细胞(主要是巨噬细胞)内,在细胞内的生存和复制是布鲁氏菌的主要毒力特征。非编码小RNA(small n...
- 王同坤
- 关键词：布鲁氏菌SRNA
- 文献传递
