王杭军
- 作品数：5 被引量：24H指数：3
- 供职机构：中国水产科学研究院珠江水产研究所更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目广东省海洋渔业科技推广专项项目更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的原核表达被引量：3
- 2013年
- 根据草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108编码VP5的M5基因的cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特异引物,进行PCR扩增;通过酶切与连接,构建2种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化,确定最适表达体系。通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。结果显示,所构建的2种VP5蛋白原核表达载体,均在大肠杆菌中成功表达了分子质量大小(约80ku)与预期相符的重组蛋白,表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎,离心收集包涵体。包涵体通过变性、透析与复性,获得纯化的重组蛋白,其中pET30c-M5/BL21(DE3)工程菌的目的蛋白占全菌蛋白的22.5%,纯化后获得了高纯度的重组蛋白(>95%)。比较2种表达载体的表达结果,pET30c-M5具有诱导表达耗时少、获得重组蛋白量大的优势,可为下一步的研究提供足量的蛋白。
- 王杭军叶星田园园张莉莉瞿兰张蕊
- 关键词：免疫印迹原核表达纯化
- 南方养殖草鱼呼肠孤病毒的分子特性比较及双重PCR检测方法的建立被引量：18
- 2011年
- 本实验室2009年从广东省患典型出血病的养殖草鱼中分离到一株具强致病性的水生呼肠孤病毒GCRV-GD108株,该毒株具有11个节段双链RNA。全基因组序列分析显示与草鱼呼肠孤病毒GCRV及水生呼肠孤病毒属其它已知种存在较大的分子差异。本研究进一步检测了广东、福建、湖南等地草鱼出血病流行毒株的分子特性。根据已克隆到的GCRV-GD108株11个节段序列分别设计合成特异引物,从各地收集患出血病草鱼,提取组织总RNA,RT-PCR检测。结果表明各检测样品均可扩增到特异性条带,而GCRV标准株则无特异条带;同时根据GCRV标准株序列合成的特异引物进行扩增,GCRV标准株有特异性条带,而各检测样品则均无带。测序结果显示各样品间相应片段序列的同源性很高（95.2%~99.4%）,与GCRV-GD108的相应序列也具高同源性（95.0%~99.8%）,说明检测样品与GCRV-GD108株具有相似的分子特性,均与GCRV及水生呼肠孤病毒属的其它种存在较大差异。本研究结果提示我国养殖草鱼出血病病毒存在着不同的分子类型,GCRV-GD108株在南方具有一定的代表性,在病害防控上尤其是疫苗研制与使用上应予关注。此外,从上述引物中筛选出适合于双重PCR的引物对,建立了双重PCR检测方法,可在一次PCR反应中鉴别所感染的病毒属于GCRV或GCRV-GD108株。
- 迟妍妍田园园叶星邓国成黎炯王杭军
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒组织特异性双重PCR
- 草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白原核表达研究
- 草鱼呼肠孤病毒是双链RNA病毒,具有多种结构蛋白,其中VP5是位于核衣壳内部的结构蛋白。本研究根据本实验室已获得的草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108编码VP5的M5基因的cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特...
- 王杭军叶星田园园张莉莉瞿兰
- 关键词：免疫印迹原核表达纯化
- 文献传递
- 草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的功能及免疫原性分析
- 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水主要养殖品种,是“四大家鱼”之一。其饲养成本低,养殖范围广,但养殖过程病害较多,其中草鱼出血病可引起草鱼大批死亡,草鱼种苗阶段受感染的死亡率高达90％,给...
- 王杭军
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒免疫原性
- 文献传递
- 草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白功能及免疫原性分析被引量：9
- 2013年
- 在前期研究中分离到一株草鱼呼肠孤病毒,GCRV-GD108,并获得其全基因组序列。该病毒株的M5基因编码VP5蛋白,该蛋白与哺乳动物正呼肠孤病毒μ2蛋白具有较高的同源性及相似的NTPase结合保守区域,推测VP5蛋白也同样具有NTPase活性。为检测VP5蛋白是否具有NTPase活性及其是否具有免疫保护作用,采用已构建的原核表达载体表达VP5重组蛋白,通过孔雀绿钼酸铵法检测纯化后的重组蛋白的NTPase活性。采用DNAstar软件预测M5基因编码蛋白的抗原性,综合蛋白亲水性、表面可及性与表面抗原性三项指标,预测编码蛋白可形成抗原表位的氨基酸区域数多达86个,提示VP5蛋白具有较强的免疫原性。用重组蛋白VP5免疫健康草鱼,通过人工攻毒实验检测VP5蛋白的免疫保护作用。结果显示,VP5重组蛋白具有NTPase活性,且其NTPase活性依赖于Mg2+或Na+/K+,而Ca2+的存在可能抑制其活性;VP5蛋白可诱导草鱼产生高水平的抗体滴度,并显著提高IgM mRNA的表达水平,但未能为草鱼提供抗GCRV感染的保护。研究首次证实GCRV-GD108株VP5蛋白具有NTPase活性,但不能为草鱼提供免疫保护作用。
- 王杭军叶星田园园张莉莉邓国成
- 关键词：活性免疫原性
