顾正华
- 作品数：62 被引量：274H指数：8
- 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程环境科学与工程更多>>
- 杨氏柠檬酸杆菌磷脂酶A1基因在E.coli中的表达
- 2015年
- 为实现磷脂酶A1(PLA1)的异源表达,将杨氏柠檬酸杆菌(CICC No.21596)PLA1基因插入载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET28a(+)-pla1,并将重组质粒转入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,获得重组菌p ET28a(+)-pla1/DE3。在IPTG诱导作用下经SDS-PAGE检测,发现在重组菌发酵破碎上清液中存在33 000大小的蛋白质,与预期蛋白质大小相符。在硼砂卵黄平板上对重组菌PLA1活性进行检测,结果显示重组菌具有明显的PLA1活性,表明PLA1基因在大肠杆菌中得到了表达。经发酵初步优化,获得摇瓶发酵的最佳诱导表达条件为:转接体积分数4%、诱导时机2 h、IPTG终浓度为0.4 mmol/L、37℃诱导培养8 h。经酸碱滴定法测得最高酶活为(5.6±0.2)U/m L。
- 姚其玉张梁石贵阳顾正华丁重阳
- 关键词：磷脂酶A1大肠杆菌
- 液态型凝乳酶储藏条件的初步研究
- 2014年
- 为进一步延长液态型凝乳酶的储藏时间,以金属离子、糖类、多羟基醇、大分子助剂和表面活性剂等为稳定剂优化得到最优的复合保护剂配方:山梨醇7.5%、明胶1%、甘油15%、吐温400.25%、氯化钾50 mmol/L;添加0.1 g/L对羟基苯甲酸乙酯可有效抑制在储藏过程中由杂茵繁殖导致的发臭、浑浊。添加复合保护剂和防腐剂的液态型凝乳酶,室温放置90 d,凝乳酶活力保留率为80.8%,比对照组提高41.6%。
- 王清伟丁明亮丁重阳顾正华张梁石贵阳
- 关键词：凝乳酶保护剂防腐剂稳定性
- 嗜热脂肪酶-无机杂化纳米花的制备及其性能研究被引量：3
- 2022年
- 为满足工业生物催化需求,寻求一种简单、快捷、有效的脂肪酶固定化方法来扩大其实际应用范围。采用声化学方法,在10 min内将脂肪酶固定于由磷酸铜沉淀所构成的无机杂化纳米花中,并进一步通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)、X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)和傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)等技术对制备的脂肪酶杂化纳米花进行表征。随后,研究了不同金属离子、金属盐离子类型、合成条件对脂肪酶杂化纳米花活性的影响。结果表明,Cu^(2+)可实现最佳固定化效果,且不同含铜无机盐类型对所形成的杂化纳米花活性存在影响。其中,使用CuSO_(4)合成纳米花可实现100%的包封率,而CuCl_(2)可使最终合成的纳米花相对酶活力达到145.7%。酶动力学研究结果表明,CuSO_(4)和CuCl_(2)纳米花的催化效率(k_(cat)/K_(m))分别是游离酶的106%和134%。此外,该固定化方法可有效提高固定化酶的储藏稳定性,在室温下储藏30 d其酶活力仍能保持在80%以上。在重复使用性研究中发现,固定化酶在连续使用5次后仍具有40%以上的催化活性。该研究结果有助于提高脂肪酶在工业生产中的适用性,并为其在生物柴油合成、洗涤剂及高温生产环境等多方面领域的应用奠定基础。
- 刘振山时祎陈剑雄辛瑜辛瑜张梁
- 关键词：脂肪酶固定化催化活性稳定性
- 乙酸钙不动杆菌磷脂酶C在大肠杆菌中重组表达、纯化及酶学性质分析被引量：2
- 2014年
- 【目的】构建乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)ATCC17902磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)的重组大肠杆菌菌株、纯化重组酶并进行酶学性质分析比较。【方法】以A.calcoaceticus ATCC17902基因组DNA为模板,PCR扩增得到两段磷脂酶C基因(PLC1、PLC2),构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,实现PLC1、PLC2基因的表达。IPTG诱导表达后,经镍柱亲和层析纯化重组蛋白。【结果】成功构建两株产磷脂酶C的重组大肠杆菌并纯化,样品经SDS-PAGE分析在80 kDa附近均出现显著的特异性条带。NPPC法测得PLC1、PLC2酶活分别为31160±418 U/mg、13640±354 U/mg,最适反应温度分别为65、50℃,最适pH值分别为8、7.5。在低于30℃时,pH值7-8时,PLC1、PLC2重组酶较稳定,40℃处理30min,PLC1酶活稳定而PLC2残余酶活低于25%。Mg2+、Ca2+增强PLC1、PLC2的活性,Zn2+增强PLC1酶活性却抑制PLC2酶活。底物特异性分析表明PLC1、PLC2均水解磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI),对其他种类磷脂不能水解或水解程度很低。【结论】本文首次实现了A.calcoaceticus ATCC17902来源的磷脂酶C的重组表达与功能验证,为其它食品安全性微生物来源的磷脂酶C的研究提供了一定的借鉴意义。
- 汪艳红张梁顾正华丁重阳石贵阳
- 关键词：磷脂酶C纯化
- 液化沙雷氏菌磷脂酶A1的克隆表达及乳糖自诱导发酵被引量：2
- 2013年
- 为了利用大肠杆菌高效生产重组磷脂酶,克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因pla,分别使用pET-28a(+)和pET-20b(+)载体,实现了磷脂酶A1在大肠杆菌BL21(DE3)中的功能表达。重组菌利用载体pET-28a(+)在原始信号肽的介导下胞外PLA1酶活达40.8 U/mL,占总酶活的91%。重组菌转接至优化后的发酵诱导培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,葡萄糖0.8 g/L,乳糖5 g/L,25 mmol/L Na2HPO4,25 mmol/L KH2PO4和1 mmol/L MgSO4;菌体生长6 h后,添加7.5 g/L的甘氨酸,37℃恒温发酵24 h,重组菌胞外PLA1酶活达到128.7 U/mL。
- 延晋雷张梁顾正华丁重阳石贵阳
- 关键词：磷脂酶A1分泌表达
- 枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化被引量：18
- 2016年
- 对1株枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵培养基以及发酵条件进行了优化,最终确定了摇瓶最佳发酵培养基为:甘油40 g/L、豆粕粉30 g/L、麸皮10 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。摇床最佳发酵条件为:温度30℃、转速250 r/min、接种量体积分数6%,在此发酵条件下,酶活达到6 082.7 U/m L,发酵强度为56 U/(m L·h)。在15 L发酵罐进行了初步验证,通过流加甘油分批发酵,在第25h酶活达到最大值,为11 871 U/m L。
- 李洪康李由然李赢顾正华丁重阳石贵阳张梁
- 关键词：中性蛋白酶枯草芽孢杆菌发酵优化
- 混合碳源对灵芝多糖发酵及其抗肿瘤活性的影响被引量：6
- 2017年
- 为了高效生产活性灵芝多糖,以葡萄糖液体发酵的基本碳源,同时添加两种灵芝多糖的主要单糖组分——半乳糖和甘露糖,研究混合碳源对灵芝生长、多糖合成及其抗肿瘤活性的影响。结果表明,以不同的混合碳源作为灵芝液态发酵的碳源,发现不同比例的单糖碳源对灵芝多糖产量和生物量影响较小。不同的灵芝多糖剂量对皮肤基底癌细胞A431和人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖均有抑制作用,碳源比例对灵芝多糖活性影响较大。葡萄糖和半乳糖以质量浓度比1∶1作碳源时抑制率可达到50%~60%;葡萄糖和半乳糖质量浓度比1∶2作碳源时抑制率可达到75%~85%;葡萄糖和甘露糖质量浓度比1∶1作碳源时抑制率可达到60%~65%;葡萄糖和甘露糖质量浓度比1∶2作碳源时抑制率可达到80%~85%;葡萄糖、半乳糖和甘露糖质量浓度比1∶1∶1作碳源时抑制率可达到80%~85%。初始培养基中半乳糖和甘露糖所占比例大有利于灵芝多糖抗肿瘤活性的发挥。
- 李洁丁重阳顾正华张梁石贵阳
- 关键词：灵芝灵芝多糖抗肿瘤活性
- 管碟法测定Nisin效价被引量：47
- 2004年
- 对管碟法测定Nisin效价的条件进行了研究,考察了几个参数的影响,得出了Nisin测定的最佳条件:90mm培养皿中培养基加量为15mL,Na2HPO4·12H2O质量浓度1g/dL,菌悬液浓度109CFU/mL,琼脂质量浓度1g/dL,培养基pH值7.0,牛津杯中样品加液量100μL.在此条件下,Nisin效价在5～100IU/mL,其对数值与抑菌圈直径有较好的线性关系.
- 伊守亮肖林顾正华章克昌
- 关键词：管碟法乳链菌肽效价测定
- 利用蔗糖产尿苷二磷酸葡萄糖的大肠杆菌构建
- 2023年
- 尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDP-glucose)不仅是细胞壁合成的前体物质,也是多种糖供体的重要前体物质。代谢工程可赋予微生物利用廉价易获得的原料生产特定化学物质的能力。该研究采用代谢工程技术改造大肠杆菌(Escherichia coli)蔗糖利用和UDP-葡萄糖合成的代谢路径,在E.coli BL21(DE3)中以蔗糖为唯一碳源,在实现细胞生长的同时促进UDP-葡萄糖的生产。通过在E.coli BL21(DE3)中共表达蔗糖通透酶基因(cscB)、果糖激酶基因(cscK)、蔗糖合酶基因(susy),确定了高拷贝数质粒(pMD19-T)和启动子串联策略(P_(csc)-P_(T7))是合成UDP-葡萄糖的最优策略,成功构建了能够利用蔗糖产UDP-葡萄糖的工程菌株ESBK09。此外,为了进一步增加菌株的稳定性,将cscB基因整合到E.coli BL21(DE3)基因组中构建工程菌株EPT03,该菌株被证明能够利用蔗糖生产UDP-葡萄糖。构建具有蔗糖利用能力的工业菌株将促进蔗糖作为碳源的使用,有助于石油化工经济向生物经济的过渡,为今后利用UDP-葡萄糖生产葡萄糖基化生物分子提供通用性底盘微生物菌株,也为后续利用UDP-葡萄糖合成相关大分子物质的代谢网络的构建提供了关键的一环。
- 姚睿赵丽婷陈磊李由然李由然石贵阳顾正华
- 关键词：代谢工程大肠杆菌蔗糖合酶
- 大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响被引量：6
- 2017年
- 【目的】比较分析苏氨酸吸收系统TdcC、SstT和LIV-1缺失对大肠杆菌吸收和积累胞外苏氨酸的影响。【方法】从菌株E.coli W3110出发,敲除tdcC、sst T和liv J基因,构建Tdc C、SstT和LIV-1系统单缺失和多缺失菌株,将过量表达苏氨酸操纵子基因的重组质粒pKKthr AC1034TBC分别转入原始菌和重组菌,考察各菌株吸收和积累胞外苏氨酸的能力。【结果】敲除tdc C和sst T基因的重组菌T04的苏氨酸吸收能力比原始菌W3110降低了43.28%,T04(pKKthr AC1034TBC)胞外苏氨酸积累量最高达到1.09 g/L,比对照菌W3110(pKKthr AC1034TBC)高出172.5%。敲除tdcC、sstT和livJ基因的重组菌T07的苏氨酸吸收能力比T04降低了12.97%,然而T07(pKKthr AC1034TBC)胞外苏氨酸积累量最大为0.63 g/L,与T04(pKKthr AC1034TBC)相比降低了42.2%。【结论】阻断Tdc C和Sst T系统,能有效降低大肠杆菌吸收苏氨酸的能力,提高苏氨酸的胞外积累量。阻断LIV-1系统,虽然能减少大肠杆菌对苏氨酸的吸收,却不利于菌株积累胞外苏氨酸。
- 杨冬美李华李由然张梁丁重阳李赢顾正华石贵阳
- 关键词：L-苏氨酸大肠杆菌基因敲除
