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谢广发: 作品数：17 被引量：84H指数：6; 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>; 发文基金：高等学校学科创新引智计划江苏高校优势学科建设工程资助项目国家重点基础研究发展计划更多>>; 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程更多>>

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YDL080C和LEU2基因敲除对工业黄酒酵母异戊醇生成量的影响被引量：9: 2015年; 通过敲除生成途径中关键酶的编码基因,对异戊醇在工业黄酒酵母N85中的生成进行了研究。采用融合PCR技术,分别构建类丙酮酸脱羧酶基因(YDL080C)缺失组件"YDL080C-URA3-YDL080C"和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)缺失组件"LEU2-URA3-LEU2",转化工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体Na-u(MATa ura3),获得单倍体工程菌Na-y和Na-l。将转化子与亲本分别进行实验室规模的黄酒发酵实验,结果 YDL080C缺失工程菌的异戊醇含量与亲本相比没有明显变化,说明类丙酮酸脱羧酶不是该途径关键酶;LEU2缺失工程菌的异戊醇含量降低16.16%,说明糖代谢途径存在,但只占小部分,而其他理化指标无明显差异。; 李童孙军勇吴殿辉李晓敏谢广发陆健; 关键词：异戊醇基因敲除

黄酒酵母ADH2、ALD2和ALD6基因敲除对黄酒中乙醛代谢的影响被引量：2: 2016年; 以工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体2a-u3(MATa ura3)为出发菌株,研究分别敲除乙醛代谢相关酶的编码基因ADH2、ALD2和ALD6对乙醛代谢的影响。采用融合PCR技术分别构建乙醇脱氢酶编码基因ADH2敲除组件"ADH2S-URA3-ADH2X"和乙醛脱氢酶编码基因ALD2和ALD6敲除组件"ALD2S-URA3-ALD2X"和"ALD6S-URA3-ALD6X",转化N85尿嘧啶缺陷型单倍体菌株后,以尿嘧啶缺陷型的恢复为筛选标记,分别获得ADH2、ALD2和ALD6基因缺失菌株2a-A2(Δadh2)、2a-D2(Δald2)和2a-D6(Δald6)。分别将获得的工程菌与亲本菌株以及前期构建的丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失菌株2a-P5(Δpdc5)进行实验室规模的黄酒发酵实验。结果表明,与亲本菌株2a相比,工程菌2a-A2发酵液中乙醛含量降低了7.14%,而2a-P5发酵液中乙醛含量降低了32.68%,说明工业黄酒酵母乙醛的生成存在糖代谢途径,并且乙醛主要由丙酮酸脱羧而来;工程菌2a-D2和2a-D6发酵液中乙醛含量与亲本相比分别增加了144.91%和88.87%,说明乙醛脱氢酶是黄酒中控制乙醛降解的关键酶,而且ALD2基因在乙醛转化为乙酸过程中发挥更关键的作用。; 刘华孙军勇谢广发陆健吴殿辉李童吴宗文; 关键词：黄酒酵母基因敲除乙醛

CRISPR/Cas9介导的低产尿素黄酒酵母工程菌的构建被引量：1: 2019年; 通过代谢工程改造构建低产尿素的酿酒酵母工程菌,从根源上减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的形成。该研究利用融合PCR构建DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”,通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术转化酿酒酵母S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1,在敲除CAR1和过表达DUR1,2基因的基础上过表达DUR3基因,获得工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1。实验室黄酒发酵实验结果表明,与亲本菌株S.cerevisiae Na相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了92.1%,EC含量降低了58.6%;与出发菌株S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了43.4%,EC含量降低了16.2%。过表达DUR3的工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1具有“尿素吸收”的能力,减少EC的形成。借助CRISPR/Cas9系统,构建的酵母工程菌无外源抗性基因的引入,具有工业化应用的潜在可能性。; 谢文娟吴殿辉吴殿辉李晓敏谢广发李晓敏; 关键词：黄酒酿酒酵母尿素氨基甲酸乙酯

低产尿素黄酒酵母工程菌的酿造特性: 2020年; 为考察酵母工程菌在黄酒酿造过程中的发酵性能及其降低发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的能力,以前期构建的降低黄酒中尿素和EC效果最好的酵母工程菌N85 DUR1,2-c为研究对象,利用单因素试验考察黄酒发酵工艺对其降低发酵液中尿素和EC能力的影响,并对其在生产试验过程中的发酵性能进行研究。结果表明,酵母接种量、发酵温度以及麦曲添加量等工艺参数对工程菌N85 DUR1,2-c低产尿素和EC的性能没有明显的影响,且含量低于亲本菌株。50 kL生产试验表明,工程菌N85 DUR1,2-c所酿黄酒中理化指标含量正常,符合黄酒国标的要求。而N85 DUR1,2-c发酵液中尿素和EC的含量分别为(2.4±0.2)mg/L和(14.9±0.6)μg/L,较亲本菌株分别降低了90.7%和54.6%,且贮存过程中EC含量增加缓慢。说明酵母工程菌N85 DUR1,2-c在不改变黄酒优良品质的前提下,能够显著地降低发酵液中尿素的含量,可以从根源上减少黄酒中EC的积累,提高饮用安全性。; 吴殿辉吴殿辉蔡国林李晓敏李晓敏陆健; 关键词：黄酒氨基甲酸乙酯尿素酿造特性

基于PCR方法敲除黄酒酵母精氨酸酶基因的工程菌构建被引量：6: 2012年; 用一种高效快速的免克隆方法-长侧翼同源PCR(LFH-PCR),构建基因敲除组件,然后通过化学转化方法把敲除组件转入黄酒酵母细胞中,利用同源重组机制精确敲除精氨酸酶基因(CAR1),构建了黄酒酵母工程菌株。结果表明,敲除CAR1基因的工程菌与出发菌株相比,酒液中尿素的含量降低了72%,氨基甲酸乙酯含量降低了38%,并且该菌株的遗传稳定性好,发酵性能与出发菌株基本一致。; 赵然然陆健谢广发; 关键词：氨基甲酸乙酯黄酒酵母

绍兴黄酒发酵过程中有机酸及产酸细菌的初步研究被引量：19: 2016年; 采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）分析了绍兴黄酒发酵过程中有机酸组成及动态变化情况,运用变性梯度凝胶电泳技术（denatured gradient gel electrophoresis,DGGE）分析了细菌群落结构变化,以纯培养结合分子生物学的方法分离、鉴定了产酸细菌,并对其发酵特性进行了研究。结果表明,乳酸、乙酸和柠檬酸是黄酒发酵过程中产生的主要有机酸,其含量占总有机酸的55%以上。有机酸的含量随发酵的进行呈递增趋势,柠檬酸、草酸、酒石酸、乳酸、苹果酸、丙酮酸和乙酸含量增幅较大（90%~385%）,琥珀酸、富马酸、α-酮戊二酸增幅较小（28%~34%）。DGGE分离及测序结果表明,黄酒发酵过程中主要的细菌有乳酸杆菌（Lactobacillus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、葡萄球菌（Staphylococcus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、链霉菌（Streptomyces sp.）以及不可培养细菌（Uncultured bacterium）等。经16S r DNA序列分析鉴定及发酵特性研究,产酸细菌主要为乳酸杆菌,其中植物乳杆菌占70%,属于异型发酵乳酸菌。; 吴宗文孙军勇吴殿辉李晓敏谢广发陆健; 关键词：有机酸乳酸杆菌绍兴黄酒

澄清剂对黄酒混浊蛋白去除效果的研究被引量：5: 2015年; 研究了单宁、硅胶和Polyclar R Brewbrite等澄清剂对黄酒混浊蛋白特异性去除的效果,并通过采用N-三(羟甲基)甘氨酸-十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱,研究了黄酒混浊蛋白及不同澄清剂吸附蛋白的分子量、蛋白质种类及来源,并比较了澄清剂处理前后酒样隆丁区分和非生物稳定性的变化。结果表明:黄酒混浊蛋白的主要成分为类燕麦蛋白和二聚α-淀粉酶抑制剂,主要来源于小麦,几种澄清剂对二聚α-淀粉酶抑制剂都有一定的吸附作用,且处理后的酒样稳定性得到提高,其中以单宁效果最为明显。; 樊世英孙军勇谢广发陆健; 关键词：黄酒澄清剂

脲基酰胺酶基因在黄酒酵母中的整合型表达被引量：7: 2012年; 氨基甲酸乙酯是一种人类的潜在致癌物,在许多发酵酒中均有存在,主要来源于发酵过程中酵母代谢产生的尿素。以pYX212为载体,将脲基酰胺酶基因DUR1,2克隆到TPI强启动子和终止子之间的位点,再通过同源重组的方式将受强启动子调控的目的基因整合到黄酒酵母的基因组中,最终获得一株低产尿素的胞内脲基酰胺酶基因组成型高表达的黄酒酵母85#DUR1,2。在实验室规模的黄酒酿造实验中,85#DUR1,2产尿素量为8.34mg/L,比出发菌株降低了69.9%,贮存一段时间后的酒液中氨基甲酸乙酯含量比出发菌株降低了40.5%,而发酵性能、酒精度、总酸及氨基态氮与出发菌株无显著差异。; 朱旭亚陆健谢广发; 关键词：氨基甲酸乙酯尿素黄酒酵母

绍兴黄酒中ACE活性抑制肽的分离分析: 首次将绍兴黄酒中的肽类组分进行大孔吸附树脂柱层析和高效凝胶过滤色谱以及反相色谱的多步提取纯化与抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性试验,并首次利用基体辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱分析和液相色谱-电喷雾电离-四极杆-飞...; 戴军陈尚卫谢广发刘俊帅桂兰顾小红赵光鳌; 关键词：黄酒血管紧张素转换酶活性肽氨基酸序列; 文献传递

绍兴黄酒麦曲中真菌研究进展: 了黄酒麦曲中真菌微生物的研究方法、麦曲中真菌微生物的构成及其影响因素、以及真菌微生物的产酶情况.研究发现，传统的微生物分离培养方法和免培养的方法都不能完全独立的揭示麦曲中真菌微生物的组成，将这两种方法有机结合起来，可以全...; 谢广发陆健; 关键词：黄酒生产麦曲

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