李海玉
- 作品数：7 被引量：12H指数：2
- 供职机构：南方医科大学更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目国家高技术研究发展计划广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 一种多肽随机文库及其构建方法和从该文库中筛选细胞穿透多肽的方法
- 本发明一种多肽随机文库，涉及生物医药领域。本发明多肽随机文库中任何一个融合蛋白组成为：用于纯化融合蛋白的标签、示踪蛋白和随机多肽，其中示踪蛋白连接在用于纯化融合蛋白的标签的羧基末端，随机多肽连接至示踪蛋白的羧基末端。本发...
- 姜勇刘亚伟刘瑜刘靖华邓鹏李海玉
- 文献传递
- 一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建被引量：8
- 2006年
- 目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性。
- 郭爱华刘志锋孙学刚李海玉邓鹏姜勇
- 关键词：融合蛋白
- 一种用于穿透多肽筛选的随机文库的构建及筛选被引量：2
- 2006年
- 以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)为示踪物,在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法,从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽(cell-penetratingpeptide,CPP).采用点突变技术,首先在pET-14b载体多克隆位点NdeⅠ和XhoⅠ之间加入4个限制性内切酶位点,随后在BamHⅠ位点后加入三联终止密码子,接着再利用亚克隆的方法在KpnⅠ和XhoⅠ之间插入EGFP,形成一个新的用于原核表达示踪蛋白的载体pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用点突变技术在上述构建的示踪载体的多克隆位点XhoⅠ和BamHⅠ之间插入36个随机碱基序列.以His-Tat-EGFP作为工具建立有效的筛选方法,利用这种方法对文库进行筛选.酶切和测序表明,示踪载体的构建是正确的,且在大肠杆菌中可有效地表达出His标记的EGFP.在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库至少包含了105个独立克隆,其中90%以上的克隆插入的随机片段都是36个碱基.建立的筛选方法是可行的,并用此方法进行了初步的筛选.
- 刘瑜刘亚伟李海玉刘靖华邓鹏姜勇
- 关键词：跨膜转运内化
- p38L12-TAT融合肽对山梨糖醇引起的ECV304细胞ATF2磷酸化的抑制作用被引量：1
- 2006年
- 构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET14bHisTATEGFP),经酶切、测序鉴定正确后,将重组质粒转化原核表达菌,诱导表达纯化融合蛋白;将融合蛋白加入ECV304细胞后于荧光显微镜下观察并行Western印迹分析,检测融合蛋白的细胞内转导活性;通过检测内源性ATF2磷酸化水平,鉴定高渗刺激下p38L12对内源性p38活性的影响.成功构建了p38L12和p38L12(AF)片段与TAT的融合表达载体,并获得相应的融合蛋白.在ECV304细胞中可见导入的HTEp38L12和HTEp38L12(AF)融合蛋白具有较高的细胞内转导活性和转导效率,并可竞争性抑制高渗刺激对内源性p38的活化.基于HIV1TAT细胞转导系统证实p38L12可竞争性抑制高渗刺激诱导的内源性p38对ATF2的活化,从而发挥对p38激活特异性抑制的功能.
- 郭爱华刘志锋李海玉唐靖李志杰刘亚伟龚小卫刘靖华邓鹏姜勇
- 关键词：LOOP
- 细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究被引量：2
- 2006年
- 目的构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体,并研究其蛋白转导功能。方法在带His标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-HE(pET14b-His-EGFP)基础上,利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽(CPP)、连接子、核定位信号(NLS)序列和EGFP的融合蛋白表达载体pET14b-HC(L)NE(pET14b-His-CPP-Linker-NLS-EGFP);经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后、用Ni2+亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中,荧光显微镜下观察并进行Westernblot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果酶切、测序证实载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核,并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体,建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统,为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。
- 李海玉郭爱华刘志锋刘瑜刘靖华邓鹏李志杰刘亚伟姜勇
- 关键词：细胞穿透肽增强型绿色荧光蛋白核定位信号蛋白转导内化
- 基于穿透肽技术的高通量多肽药物筛选系统的建立
- 炎症(inflammation)是一种广泛的病理生理反应，参与多种疾病的发生和发展，如脓毒血症、系统性炎症反应综合征、缺血再灌注损伤等常常伴随剧烈的急性炎症反应。慢性炎症是类风湿关节炎、慢性骨病、慢性炎性肠病、脂肪沉积性...
- 李海玉
- 关键词：炎症药物筛选细胞穿透肽蛋白转导
- 文献传递
- 一种多肽随机文库及其构建方法和从该文库中筛选细胞穿透多肽的方法
- 本发明一种多肽随机文库，涉及生物医药领域。本发明多肽随机文库中任何一个融合蛋白组成为：用于纯化融合蛋白的标签、示踪蛋白和随机多肽，其中示踪蛋白连接在用于纯化融合蛋白的标签的羧基末端，随机多肽连接至示踪蛋白的羧基末端。本发...
- 姜勇刘亚伟刘瑜刘靖华邓鹏李海玉
- 文献传递
