赵文君
- 作品数：9 被引量：31H指数：4
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- 内质网分子伴侣BiP缺失突变体的构建及生物信息学分析
- 免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP),又称GRP-78或HspA5,是位于内质网(ER)的重要分子伴侣,属于热休克蛋白(Hsp70)家族成员之一.BiP与许多内质网蛋白都有短暂的相互作用,是内质网维持内环境稳态的一个感应器,...
- 李祥柱赵文君刘平刘艳娜周菁华郭风劲
- 关键词：内质网分子伴侣BIP生物信息学重叠PCR
- 分子伴侣BiP结构域分析及对肝癌细胞增殖和凋亡的影响被引量：5
- 2011年
- 结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BiP),是Hsp70(70 kilodalton heatshock proteins)蛋白家族的成员之一,是内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)主要的调节器。为了研究BiP的分子结构与生物学功能的关系,首先,分析BiP的DNA序列和蛋白质空间构象,接着利用重叠PCR方法分别克隆ATPase结构域缺失体和peptide-binding结构域缺失体(BiPa和BiPp),成功构建带myc标签的真核表达载体,转染LO2细胞和SMMC-7721细胞,应用免疫印迹方法检测其在细胞内的表达;运用MTT法、BrdU免疫组化法及流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡;检测BiP及两个组成结构域对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。酶切、电泳和DNA测序结果显示,BiP全长和两个缺失体的真核表达载体构建成功;免疫印迹检测到BiP三种真核载体在LO2细胞和SMMC-7721细胞中均能正确表达;MTT和BrdU免疫组化结果表明,BiP全长和缺失体BiPa、BiPp三种真核载体均能有效促进SMMC-7721的增殖,各组间细胞增殖率结果分析提示ATPase功能域可能抑制细胞增殖,而peptide-binding结构域可能促进细胞的增殖;流式细胞仪结果显示,转染BiP、BiPa、BiPp三种真核载体均可以促进SMMC-7721的凋亡,缺失体BiPa与全长BiP组间凋亡率差异不显著;而缺失体BiPp组细胞凋亡率明显低于全长BiP组,两组差异具有显著性(P<0.05);提示ATPase功能域与细胞凋亡可能不相关,而peptide-binding结构域可能促进细胞的凋亡。上述结果表明,BiP的两个组成结构域:ATPase功能域与peptide-binding结构域,独立存在或者共同存在时,调控细胞增殖与凋亡具有差异性;当两个结构域共同存在时,它们会协同调控细胞的增殖与凋亡,具体的分子机制还需要进一步的实验研究和探讨。
- 李祥柱刘艳娜赵文君周菁华郭风劲
- 关键词：BIP生物信息学细胞增殖
- 内质网应激对ATF6调控XBP1启动子转录的影响被引量：11
- 2012年
- 目的确定XBP1启动子的转录核心区域,探讨激活转录因子6(ATF6)在内质网应激(ERS)与非ERS状态下对XBP1启动子转录活性的调控作用。方法采用基因重组技术构建ATF6基因及两个缺失体ATF6s1p、ATF6s2p的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ATF6、pcDNA3.1(-)-s1p、pcDNA3.1(-)-s2p,以及XBP1启动子报告基因载体pGL3-XBP1。针对XBP1启动子的各个组成元件设计和构建XBP1一系列截短体的报告基因载体。采用双荧光素酶报告基因法检测并确定XBP1启动子的核心启动子区,Western blotting检测ATF6及缺失体s2p、s1p在ERS与非ERS状态下对XBP1核心启动子区转录的调控作用。结果 XBP1启动子的-407bp-+133bp区域是转录活性调控的核心区域,-2000bp--407bp区域不具有转录活性,该区域可能含有抑制转录活性的组成元件。非ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p可明显上调XBP1启动子的转录活性及XBP1蛋白表达;而在ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p下调了XBP1启动子的转录活性和XBP1蛋白表达。结论 ATF6对XBP1的转录调控作用在ERS状态和非ERS状态下存在差异。非ERS状态时,ATF6上调XBP1的转录和表达,而ERS状态时,ATF6下调XBP1的转录和表达。
- 赵文君朱慧芳周菁华李祥柱刘艳娜郭风劲
- 关键词：基因表达调控转录启动子
- 转录因子XBP1S对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响被引量：9
- 2011年
- 目的:探讨人剪接型X盒结合蛋白1(X-box binding protein1spliced,XBP1S)对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用衣霉素(tunicamycin,Tm)和毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)建立HepG2细胞的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)模型。将XBP1S真核表达载体pcDNA3.1(-)-XBP1S和靶向XBP1S的RNA干扰质粒pSUPER-XBP1S转染HepG2细胞,MTT法检测细胞的增殖能力,荧光显微镜下观察细胞的形态学变化,FCM法检测细胞凋亡率,Western印迹法检测caspase12的表达。结果:转染pSUPER-XBP1S可有效抑制细胞增殖,而转染pcDNA3.1(-)-XBP1S可促进细胞增殖。荧光显微镜下可见Tm处理组细胞出现细胞凋亡的形态学改变,进一步下调XBP1S的表达可使这一改变增强。对照组、Tm组、Tm+pSUPER-XBP1S转染组和Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组细胞的凋亡率分别为5.21%、41.51%、52.15%和35.87%,差异有统计学意义(P<0.05)。HepG2细胞中caspase12的表达,Tm组高于对照组,Tm+pSUPER-XBP1S转染组高于Tm组,Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组低于Tm组。结论:XBP1S可以促进肝癌HepG2细胞增殖,抑制或促进XBP1S表达可调节ERS介导的细胞凋亡。
- 林建炜刘平向廷秀李祥柱赵文君郭风劲
- 关键词：肝肿瘤内质网应激细胞增殖
- 靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响被引量：1
- 2010年
- 目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体（pSUPER-XBP1S）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.
- 林建炜刘平李祥柱赵文君郭风劲
- 关键词：SIRNA真核表达载体
- 转录因子XBP1S基因表达谱差异分析被引量：1
- 2010年
- 目的 应用基因表达谱芯片技术了解XBP1S在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法 构建pcDNA3.1（-）-XBP1S真核表达载体,转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1（-）处理相同细胞系作为对照.48 h后制备细胞裂解液,提取mRNA,应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行基因表达谱芯片技术分析.经过差异基因表达谱的筛选,发现HepG2细胞转染XBP1S以后,有38个基因表达水平显著上调,30个基因表达水平显著下调.结论 成功构建XBP1S的真核表达载体pcDNA3.1（-）-XBP1S,运用基因表达谱芯片技术成功筛选了XBP1S转染细胞后的差异表达基因,这些差异表达基因包括细胞周期、蛋白质的翻译合成及运输、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号转导等方面起重要作用及肿瘤发生相关的基因,为进一步阐明XBP1S可能存在的调控机制及XBP1S蛋白可能的生物学功能提供理论依据.
- 郭风劲林建炜刘平李祥柱赵文君
- 关键词：转录因子基因芯片
- ATF6对XBP1基因转录调控机制的实验研究
- 目的：确定XBP1基因启动子的转录核心区域及ATF6在内质网应激状态(Endoplasmic reticulum stress，ERS)与非应激状态时对XBP1启动子转录活性的调控作用。 方法：采用基因重组技术构...
- 赵文君
- 关键词：启动子转录活性内质网应激
- IRE1结构域分析及截短型载体的构建和表达被引量：5
- 2011年
- 目的 克隆IRE1基因,根据IRE1基因不同生物学功能的4个结构域构建截短型真核表达载体,并用生物信息学方法对其蛋白产物进行分析.方法 应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板扩增IRE1全长及4个截短型片段,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测各重组载体在细胞中的表达,并利用SWISS-MODEL在线软件预测其蛋白结构.结果 酶切鉴定及Western 印迹结果表明成功构建了IRE1全长及每一种截短型片段的真核表达载体：pcDNA3.1（-）-IRE1（pIRE1）,pcDNA3.1（-）-IRE1-NLDP（pNLD）,pcDNA3.1（-）-IRE1-KinaseP（pKinase）,pcDNA3.1（-）-IRE1-R＋L（pR＋L）,pcDNA3.1（-）-IRE1-RNase（pRNase）.结论 IRE1及其截短型真核表达载体的成功构建和表达,为进一步研究IRE1各个结构域的生物学功能奠定了基础.
- 刘平李祥柱赵文君刘艳娜周菁华郭风劲
- 关键词：内质网应激结构域
- IRE1α上调人骨肿瘤细胞XBP1启动子转录活性的研究被引量：3
- 2012年
- 目的研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响。方法在成功构建人IREla基因全长重组质粒的基础上，设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体（pS1；pS2）；采用巢式PCR扩增XBP1启动子，插入到pGL3．Basic载体，构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1。分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBPl报告基因重组质粒共转染人SW1353细胞和Saos-2细胞中，48h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用。结果酶切及测序结果证实siRNA1干扰质粒和XBPl启动子真核表达载体均构建成功，双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中，直接载体pcDNA3．15（-）IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组（P〈0．5），并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和；而silRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低。免疫印迹结果显示，过表达IRE1α明显上调剪接型XBPlS蛋白的表达。结论人恶性骨肿瘤细胞中，过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达，并能有效促进XBPIU剪切生成XBPIU；通过siRNA方法抑制IRE1α后，XBP1启动子的转录与表达受到抑制。本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础，为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据。
- 李祥柱赵文君刘艳娜周菁华郭风劲
- 关键词：转录活性骨肿瘤
