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重组抗狂犬病病毒抗体在HEK293 EBNA1细胞中的瞬时表达优化被引量：4: 2015年; 目的:优化重组抗体在悬浮无血清培养的HEK293 EBNA1瞬时表达,提高重组抗体表达量。方法:将HEK293 EBNA1细胞适应于无血清悬浮培养,筛选适宜的无血清培养基。使用PEI转染质粒进入细胞,瞬时表达重组抗体;使用Modde软件进行实验设计(DOE),优化转染质粒量、轻重链比例、PEI量等影响瞬时表达的条件。培养上清经亲和纯化,获得目标抗体,用快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)测定抗体活性,用BCA法测定纯化抗体浓度。结果:293SFMII为适宜的HEK293 EBNA1细胞无血清悬浮培养基。对抗体表达影响最大的因素是轻重链比例(P=0.00000),其次为质粒浓度(P=0.00086),最后为PEI(P=0.00257)。优化的转染条件为:质粒用量0.61μg/106细胞,轻重链比例2:1,PEI 2.67μg/106细胞,优化后抗体表达量有显著提高(P=0.007)。结论:通过DOE优化获得了重组抗狂犬病病毒抗体的高水平表达,抗体表达量提高了至少50倍。; 陈继军秦海艳安晨乔玉玲李晓进毛晓燕; 关键词：HEK293 EBNA1

冻干人血浆补体的制备及其稳定性被引量：3: 2016年; 目的制备冻干人血浆补体,并观察其在4种不同保存温度条件下的稳定性。方法制备3批冻干人血浆补体,将每批样品分别保存在-70、4、25和37℃条件下,采用补体50%溶血试验测定于-70和4℃条件下保存第1、15、30、60、90、120、180、270、365天以及于25和37℃条件下保存第1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120天的CH_(50);细胞增殖-毒性检测法测定补体对抗CD_(20)抗体CDC活性检测的影响。结果-70和4℃保存的3批冻干人血浆补体,1年内CH_(50)平均下降了19.5%和36.3%,25和37℃保存的3批冻干人血浆补体,3个月CH_(50)平均下降了53.4%和60.7%。与上市补体和CH_(50)为30 U/ml的冻干人血浆补体相比,CH_(50)为15 U/ml的冻干人血浆补体对抗CD_(20)抗体CDC活性检测结果无影响。结论在-70和4℃条件下保存的冻干人血浆补体的CH_(50)相对较稳定,但随着保存温度的升高,CH_(50)下降有加速的趋势。CH_(50)大于15 U/ml的冻干人血浆补体可用于治疗性抗体CDC活性检测。; 秦海艳熊颖乔玉玲陈继军安晨毛晓燕; 关键词：血浆冷冻干燥补体稳定性

人源抗破伤风毒素单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及功能鉴定被引量：2: 2009年; 实验通过DNA重组技术从一株可中和破伤风毒素的人源单克隆抗体细胞(G6)中扩增出了抗体VH、VL的基因,通过重叠PCR使连接片段与VH、VL连接成单链ScFv。经测序证实VH、VL为抗体的可变区序列,命名为ScFv-G6。将ScFv-G6连接转化PET/26b质粒,构建了抗体的表达载体,被命名为PET/26b/ScFv-G6。以该载体在大肠杆菌中分泌表达产物经Ni-亲和柱纯化后的小鼠试验证实,可抵抗破伤风毒素的攻击,表明为中和抗体。具有组织穿透力强,不易过敏,可直接靶向于毒素等特点,适合于破伤风的防治,具有重要的应用价值。; 熊颖李晓进乔玉玲毛晓燕龟井优德赵红; 关键词：单链抗体原核表达中和活性

抗狂犬病病毒单链抗体的筛选及鉴定被引量：3: 2013年; 目的:利用噬菌体展示技术构建的噬菌体抗体库,筛选、表达及鉴定具有体外中和活性的抗狂犬病病毒单链抗体。方法:以21份接受狂犬病病毒疫苗免疫的健康人外周血构建的抗狂犬病病毒scFv噬菌体免疫库为基础,免疫管包被纯化狂犬病病毒颗粒,通过三轮筛选,ELISA检测单克隆噬菌体抗体颗粒的阳性率,DNAStar和Vbase2对阳性克隆进行序列分析。序列正确的单链抗体构建原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达单链抗体。经压力破碎、镍亲和层析对表达的蛋白进行纯化。RFFIT检测纯化蛋白对狂犬病病毒的体外中和活性。同时使用间接ELSIA检测获得的scFv对3aG,CVS,CTN及PV株的交叉反应性。结果:共获得40个阳性、基因测序结果正确的单链抗体。其中7个获得原核表达菌株,但只有3个获得较高的可溶性表达。RFFIT结果表明有4个scFv比活大于500 IU/mg。7个scFv对4种病毒株均有一定的交叉反应。结论:成功从该scFv噬菌体免疫库中筛选出特异性scFv;RFFIT结果表明获得的scFv具有体外中和狂犬病病毒的活性。; 陈继军毛晓燕乔玉玲毕司英; 关键词：单链抗体狂犬病病毒

大肠杆菌表达的破伤风C片段的纯化及免疫原性分析: 目的:建立纯化大肠杆菌重组表达的破伤风毒素C片段(tetanus toxin C fragment,TTc)的纯化工艺,验证免疫原性。方法:通过硫酸铵沉淀、疏水层析及离子交换层析三步纯化目的蛋白。腹腔3剂免疫BALB/c...; 陈继军毛晓燕王建锋乔玉玲; 关键词：纯化免疫原性; 文献传递

单链抗体的研究进展被引量：18: 2011年; 单链抗体即单链抗体可变区片段(single-chain antibody variable fragment,or ScFv)是由抗体重链可变区和轻链可变区通过一段10-25个氨基酸的连接肽连接而成,其分子质量小,穿透力强,特异性好,免疫原性低,在免疫学和医学方面得到了广泛应用。本文就单链抗体的结构设计、展示系统、表达和应用方面做一综述。; 秦海艳毛晓燕乔玉玲李晓进赵红; 关键词：单链抗体

重组破伤风毒素C片段的纯化及其免疫原性被引量：4: 2011年; 目的建立大肠杆菌表达的重组破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment,TTc)的纯化工艺,并检测其免疫原性。方法取超声破碎后的重组菌上清,经硫酸铵沉淀、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清抗体水平。结果经3步纯化,目的蛋白纯度达96.7%;经还原及非还原SDS-PAGE分析蛋白条带一致,相对分子质量约为50 000,不含多聚体,为单体蛋白;纯化的TTc可刺激小鼠产生免疫应答,但血清抗体水平显著低于破伤风类毒素组(P<0.05)。结论已建立了大肠杆菌表达的重组TTc的纯化工艺,纯化的TTc对小鼠具有免疫原性。; 陈继军毛晓燕王建锋乔玉玲; 关键词：破伤风毒素纯化免疫原性

破伤风毒素C片段(TTc)在大肠杆菌中的表达、优化与鉴定: 以一株破伤风生产菌株为模板，通过上游引物中几个碱基的修改，PCR扩增出破伤风C片段(TTc)基因，构建了原核表达质粒pET-42(b)/TTc在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，重组蛋白分子量约50KD，表达量为22％，...; 毛晓燕乔玉玲王云天熊颖赵红; 关键词：表达条件优化大肠杆菌亚单位疫苗载体蛋白生物制品; 文献传递

人源天然ScFv噬菌体抗体库的构建及鉴定被引量：8: 2010年; 噬菌体抗体库技术是获得治疗性抗体的一条重要途径。以20份健康人外周血为样本,通过提取淋巴细胞、逆转录-PCR(RT-PCR)、抗体可变区基因的扩增、重叠PCR获得单链抗体(ScFv)基因,将ScFv克隆入噬粒载体,通过近300次的电转化获得了库容量为1.3×109的全人源天然ScFv噬菌体抗体库。通过随机挑克隆测序和用5种不同抗原筛选对抗体库进行了初步验证。随机测序表明抗体库具有较好的多样性,用5种不同抗原对其进行筛选,均获得了特异性噬菌体抗体的不同富集,表明成功构建了一个多样性良好的人源天然ScFv噬菌体抗体库。; 毛晓燕乔玉玲卢卫嘉马瑞赵红; 关键词：噬菌体展示技术抗体库

从人源天然ScFv噬菌体抗体库中筛选A型肉毒毒素特异性抗体被引量：5: 2011年; 目的:以不同形式的A型肉毒毒素或类毒素为靶抗原,对已经构建的人源天然ScFv噬菌体抗体库进行特异性抗体的筛选及特异性抗体的序列分析。方法:制备3种不同形式的A型肉毒毒素或类毒素,抗原梯度包被免疫管,对人源天然ScFv噬菌体抗体库进行筛选,经过3轮"吸附-洗脱-扩增"淘选富集,制备单克隆噬菌体抗体颗粒,用ELISA验证ScFv的结合活性,并对获得的阳性克隆进行基因序列分析。结果:用3种不同形式的抗原进行筛选,各挑180个克隆进行单克隆噬菌体抗体颗粒的ELISA分析,其中以A型肉毒类毒素筛选获得52个阳性克隆,阳性率为28.8%,随机挑取12个克隆测序,结果表明7个ScFv序列正确且各不相同;以纯化后A型肉毒神经毒素(BONT/A)筛选获得18个阳性克隆,阳性率为10%,测序结果表明获得的14个ScFv序列正确且各不不同;以原核表达的A型肉毒毒素重链C段筛选获得122个阳性克隆,阳性率为68%,随机挑取55个克隆测序,结果表明30个正确的ScFv序列中14个系列完全相同,16个序列各不相同;结论:应用固相筛选的方法,从人源天然ScFv噬菌体抗体库可以获得肉毒毒素特异性抗体,为抗肉毒毒素马血清的更新替换提供了研究依据与应用基础。; 毛晓燕卢卫嘉乔玉玲熊颖张超马瑞; 关键词：噬菌体抗体库 A型肉毒毒素

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