刘芳
- 作品数：14 被引量：36H指数：3
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- 用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素
- 2006年
- 目的利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)。方法采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定。结果高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L。结论用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性。
- 马卫列刘芳何承伟
- 关键词：内皮抑素融合蛋白肿瘤
- RNA干涉—肿瘤相关基因功能研究的利器被引量：3
- 2004年
- 将双链RNA(dsRNA)导入细胞或通过载体在细胞内转录成具有发夹结构的dsRNA ,能够高效特异地剔降同源基因表达 ,形成相应的功能缺陷表型 ,称为RNA干扰 (RNAi)技术。利用该技术研究基因的功能是目前的热门课题。现着重对RNAi应用于肿瘤相关基因的功能研究作一综述 。
- 刘芳周克元
- 关键词：肿瘤相关基因RNAI技术肿瘤侵袭
- 硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定
- 2006年
- 目的:将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素(endostatin)进行纯化并对其生物学活性进行测定.方法:将含有pThioHis-endo重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定.结果:经SDS-PAGE电泳分析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性,加入重组蛋白内皮抑素5μg组与10μg组血管生成抑制率分别为(22.3±2.0)%和(47.1±4.0)%,P<0.05,和对照组经过方差分析,差异都有显著性意义;内皮细胞抑制实验可见不同剂量重组蛋白内皮抑素对内皮细胞的生长具有抑制作用[抑制率分别为(49.6±4.1)%,(53.2±2.3)%,(55.0±3.6)%,(67.1±5.7)%],经过方差分析和相关性分析,具有剂量依赖效应(r=0.984,P<0.05).结论:用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.
- 马卫列刘芳何承伟何振辉
- 关键词：内皮抑素融合蛋白
- 一种质粒介导的RNAi系统的建立
- 2004年
- 目的 构建mU6启动子驱动的，在真核细胞内表达短发夹状RNA(short hairpin RNA，shRNA)的质粒载体；以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)为靶点观察该载体介导的RNAi效应。方法 从已知质粒中获取mU6启动子，经亚克隆后替换pcDNA3质粒中的CMV启动子，构建成pmU6质粒；设计并构建能表达针对GFP的shRNA的重组质粒，与表达GFP的质粒共转染细胞，用流式细胞仪检测GFP的表达水平。结果 表达shRNA的pmU6质粒载体转染细胞后抑制了细胞中GFP的表达，针对GFP基因不同位点的shRNA的RNAi效应差异很大。结论 pmU6质粒载体能介导RNAi效应，该载体可作为RNAi用于基因功能和基因治疗研究的有用工具。
- 何承伟刘芳张月飞剧克元
- 关键词：质粒载体质粒介导共转染流式细胞仪检测靶点GFP
- 一个质粒介导的RNAI系统的建立及其在体外抑制NPC细胞株生长中的应用
- 目的：鼻咽癌(NPC)是我国华南地区常见的一种恶性肿瘤，其发生有明显的地域性和家族集聚现象。研究表明其发病机理除与EB病毒感染、化学致癌物有关外，与遗传易感基因也有着密切的关系。RNA干扰(RNAINTERFER...
- 刘芳
- 关键词：RNA干扰BCL-XL
- 文献传递网络资源链接
- 用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素的方法研究被引量：3
- 2006年
- 目的探索用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)重组蛋白的最佳生产工艺路线。方法用pTh ioH is-endo重组质粒转化不同的大肠杆菌BL21、JM109、DH5α,经几种不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(isopro-pylth io-galactoside,IPTG)诱导表达重组融合蛋白,或诱导表达不同时间后,采用SDS-PAGE分析表达产物;按所优化的条件进行重组内皮抑素的表达、包涵体的提取、洗涤、变性和复性,最后经N i+柱纯化,再通过SDS-PAGE分析纯化的结果。结果3种大肠杆菌表达效果相差无几,最佳IPTG的浓度0.9 mmol/L,最佳诱导时间为5 h,经N i+柱纯化后可获得可溶性的重组内皮抑素。结论利用本实验的优化条件可获得高产量、高纯度、可溶性的小鼠内皮抑素重组蛋白。
- 马卫列刘芳何承伟
- 关键词：ENDOSTATIN融合蛋白
- 新的凋亡抑制因子Livin被引量：8
- 2004年
- Livin是新近发现的一个凋亡抑制因子 ,属于抑制细胞凋亡蛋白 (inhibitorofapoptosisprotein ,IAP)家族的新成员 ,主要通过抑制胱天蛋白酶 3/ 7/ 9(caspase 3/ 7/ 9)的活性来阻断细胞凋亡过程。Livin特异地表达于胚胎发育组织和大多数实体瘤 ,正常成人的绝大多数组织中也有表达。Livin抑制细胞凋亡 ,与肿瘤的发生、发展及预后相关 ,有望成为肿瘤治疗的新靶点。
- 刘芳周克元
- 关键词：凋亡抑制因子LIVIN细胞凋亡肿瘤凋亡抑制蛋白
- 质粒表达的短发夹状RNA特异性抑制鼻咽癌细胞的增殖
- 2005年
- 目的 观察pmU6 sibclD重组体在细胞内表达的bcl xL短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)能否特异地抑制人鼻咽癌CNE 2Z细胞的增殖。方法 将自行构建的表达短发夹状RNA的重组质粒转染到人鼻咽癌CNE- 2Z细胞株、卵巢癌HO 8910细胞株和正常人类肝脏L- O2 细胞株中,流式细胞仪检测转染率, MTT 比色法检测细胞的生长抑制率。结果 bcl xLshRNA能特异地抑制CNE 2Z细胞株的生长增殖,而对正常人类肝脏细胞株的生长增殖和HO 8910 细胞中的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的表达无抑制作用。结论 pmU6 sibclD重组体在细胞内表达的短发夹状RNA能特异性抑制鼻咽癌细胞的生长增殖,为质粒介导的RNAi技术运用于肿瘤的基因治疗提供一定的理论依据。
- 刘芳何承伟周克元张月飞
- 关键词：RNA干扰转染短发夹状RNABCL-XL
- RNA干涉作用机制的研究进展被引量：2
- 2005年
- 何承伟刘芳刘新光梁念慈
- bcl-x_L短发夹状RNA诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡(英文)被引量：13
- 2005年
- 背景与目的:实验证明bcl-xL 在鼻咽癌细胞株CNE-2Z 中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展、转移及治疗过程中产生耐药等方面发挥重要作用。本研究拟探讨bcl-xL 短发夹状RNA (shorthairpin RNA ,shRNA )诱导CNE-2Z 细胞凋亡的作用。方法:把表达bcl-xL shRNA 的重组质粒pm U6-RNAi转染到CNE-2Z细胞中,用荧光染色和流式细胞术等方法检测细胞凋亡;用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polym erase chain reaction,RT-PCR )检测bcl-xL、bcl-2、survivin和caspase-3的m RNA 表达水平;用W estern blot检测Bcl-xL、Caspase-3和P53的蛋白表达水平。结果:流式细胞术检测发现,pm U6-RNAi重组质粒作用24h 后,细胞出现明显的凋亡峰;H oechst33258单染在荧光显微镜下可见细胞缩小、染色质固缩和核断裂;RT-PCR 分析pm U6-RNAi重组质粒作用细胞后明显下调了bcl-xL、bcl-2和caspase-3的m RNA 表达水平, 对survivin 的m RNA 表达水平无影响;W estern blot分析pm U6-RNAi质粒作用细胞后明显下调了Bcl-xL、Caspase-3的蛋白表达水平,而大幅度上调了P53的蛋白表达水平。结论:bcl-xL shRNA 可诱导CNE-2Z 细胞凋亡;CNE-2Z 细胞的凋亡可能与bcl-2、caspase-3和p53有着密切的关系;质粒表达的bcl-xL shRNA
- 何承伟刘芳张月飞梁统周克元
- 关键词：鼻咽肿瘤短发夹状RNABCL-XL细胞凋亡
