高玉伟
- 作品数：277 被引量：755H指数：13
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- 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- 鼠源Bif-1蛋白7种选择性剪接异构体真核表达质粒的构建及鉴定被引量：1
- 2017年
- 目的构建鼠源Bif-1(Bax-interacting factor-1)蛋白7种选择性剪接异构体(alternatively spliced isoforms)真核表达质粒,并在BHK和N2a细胞中表达。方法以提取的N2a细胞总RNA为模板,采用RT-PCR、重叠延伸PCR等方法扩增目的基因Bif-1(transcript variant 1、transcript variant 2、transcript variant 3、transcript variant x1、transcript variant x2、transcript variant x3、e),并将目的基因连入真核表达载体p IRES2-EGFP,构建重组质粒。重组质粒经鉴定正确后经脂质体介导转染BHK和N2a细胞,采用荧光显微镜观察及Western blot法检测转染细胞中Bif-1蛋白的表达。结果琼脂糖凝胶电泳可见与预期大小相符的核酸条带;重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定证明构建正确;重组质粒转染BHK或N2a细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光;Westen blot可检出相应大小的目的条带。结论成功构建了鼠源Bif-1蛋白7种选择性剪接异构体真核表达质粒,并在BHK和N2a细胞中获得表达。为进一步探索Bif-1蛋白不同选择性剪接异构体的生物学功能,研究其在细胞自噬、细胞凋亡以及抗肿瘤等方面的作用奠定了基础。
- 侯朋飞金宏丽金宏丽曹增国李岭曹增国吴芳芳闫飞虎李国华赵永坤高玉伟王化磊
- 关键词：真核细胞基因表达
- SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达被引量：1
- 2005年
- 对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。
- 杨松涛夏咸柱乔军高玉伟常爽黄耕郑明光
- 关键词：SARS病毒N蛋白基因克隆
- 犬冠状病毒基因疫苗表达载体的构建及其免疫原性研究被引量：2
- 2006年
- 以pVAX1为载体首次构建了犬冠状病毒病基因的3种真核表达质粒。首先将犬冠状病毒大熊猫株(CCV DXMV)纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。将测序后的质粒pTS、pTM和pTN分别双酶切,回收目的基因片段并将其定向克隆到真核表达质粒pVAX1中得到重组质粒pVAXS、pVAXM和pVAXN。将这3种真核表达质粒通过脂质体介导法转染MDCK细胞,通过RT-PCR法进行转录水平的检测,并用间接ELISA法检测目的蛋白的表达情况。结果在pVAXS、pVAXM、pVAXN转染MDCK细胞36 h后就可检测到目的基因的转录;在转染72 h后可检测到3种目的蛋白的表达。动物免疫试验表明,3种真核表达载体能有效地诱导机体产生细胞免疫与体液免疫应答,这为CCV基因疫苗的研究奠定了良好的基础。
- 乔军夏咸柱杨松涛郝峰高玉伟郑晓一黄耕
- 关键词：犬冠状病毒免疫原性
- AIV高免血清对H5N1亚型高致病性禽流感的紧急预防效果研究
- 应用马抗流感病毒高免血清,以不同剂量(0.2mL,0.1mL,0.05mL)和不同时间(攻毒前8天、4天、1天)给小鼠进行腹腔注射,探讨其对抗高致病性禽流感病毒感染的紧急预防效果.结果表明:在以30个LD50病毒对小鼠进...
- 王承宇王化磊杨松涛高玉伟冯娜王铁成邹啸环王定坤夏咸柱
- 关键词：致病性禽流感高免血清H5N1亚型
- 文献传递
- 裂谷热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：3
- 2014年
- 目的建立一种快速、敏感、特异的Real-time PCR(实时荧光定量PCR)方法,用于裂谷热病毒(RVFV)的检测。方法根据裂谷热病毒N蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测裂谷热病毒所绘制标准曲线的相关系数大于0.99,灵敏度为1.0×101拷贝,高于常规PCR方法(1.0×103拷贝);除裂谷热病毒外的其他7种对照烈性病病原体基因检测均呈阴性;批内重复和批间重复的变异系数均小于1%。结论建立的裂谷热病毒Real-time PCR检测方法敏感性和特异性较高,可用于裂谷热病毒感染快速诊断及流行病学调查。
- 盖微微迟航迟航薛向红郑学星王化磊薛向红赵永坤高玉伟黄耕王化磊夏咸柱
- 关键词：PCRTAQMAN探针
- 犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定被引量：7
- 2014年
- 用纯化后的犬瘟热病毒免疫Balb/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株,并挑选阳性孔进行亚克隆,用Vero细胞交叉反应试验及间接免疫荧光检测单克隆抗体的特异性。结果获得2株能稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体细胞株,分别命名为062-1、062-2。实验室已有的一株单克隆抗体为6H8。交叉反应试验及间接免疫荧光染色检测表明,3株单克隆抗体的特异性较好;经过体外连续传代及反复冻存、复苏,杂交瘤细胞均能稳定分泌特异性单克隆抗体。培养上清液及小鼠腹水间接ELISA效价分别为1∶105和1∶108。相加试验表明,单克隆抗体062-1、062-2具有共同的表位,而单克隆抗体6H8识别的位点与其他两株不同。
- 王铮王铁成冯娜虞一聪高玉伟杨松涛夏咸柱
- 关键词：犬瘟热病毒单克隆抗体间接酶联免疫吸附试验
- 特异性干扰PB-1基因对H5N1高致病性禽流感病毒复制的影响被引量：1
- 2013年
- 针对H5N1高致病性禽流感病毒PB-1基因,通过RNA干扰技术,设计siRNA,研究其抑制病毒复制的效果.siRNA转染MDCK细胞并接毒后,病毒滴度测定、Real-time PCR和间接免疫荧光试验结果显示,所设计的siRNA(ps-PB1-777)具有明显的抑制病毒复制的效果,PB-1基因的拷贝数和病毒蛋白表达都下降.设计的siRNA可显著抑制高致病性禽流感病毒的复制.因此,本研究中PB-1基因的有效siRNA可为预防和治疗H5N1高致病性禽流感提供合理的技术支持和物质储备.
- 张伟王铁成王承宇杨松涛高玉伟夏咸柱
- 关键词：禽流感干扰RNA
- A型流感病毒跨种传播和致病性相关蛋白研究进展被引量：4
- 2011年
- A型流感病毒是重要的人和动物病原体,每年都会在人群中引发季节性流感流行,偶尔还会引发全球流感大流行,对公共卫生安全构成严重威胁。研究发现,A型流感病毒的跨种传播与该病毒的多个蛋白有关,其中血凝素是该病毒宿主范围的主要限制因素,但聚合酶蛋白和非结构蛋白1(NS1)的作用也不容忽视。A型流感病毒通过不断地适应各类宿主和长期地进化,每年都能够产生大量致病性未知且具有潜在流行性的新毒株,人们经过长期地研究发现,A型流感病毒的致病性主要受该病毒的聚合酶蛋白、血凝素蛋白和非结构蛋白1(NS1)上某些特定氨基酸的影响。论文从以上几方面对A型流感病毒跨种传播和致病性分子机制的研究进展进行综述。
- 于志君朱晓文刘红李硕范宝静王世申吴静武艳丽王铁成杨松涛黄耕高玉伟夏咸柱
- 关键词：A型流感病毒分子机制
- 犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株的反向遗传操作系统及其应用
- 本发明涉及一种犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)CDV/R-20/8疫苗株的反向遗传操作系统及其应用，该系统包含：转录质粒，所述转录质粒能够表达所述犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株的基...
- 步志高夏咸柱王喜军冯娜葛金英高玉伟
- 文献传递
- H9N2亚型AIV鼠肺适应株的获得及其氨基酸变异分析被引量：2
- 2015年
- 【目的】将H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠体内连续性传播9代后,能够稳定的在豚鼠间传播,可见H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的感染能力以及在哺乳动物间传播的能力还是很强的。因此,使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)简称JN,应用小鼠动物模型,研究H9N2亚型流感病毒在小鼠肺内适应性传代后对小鼠的致病力,以及传代过程中流感病毒的变异。检测和筛选流感病毒致病性变异的关键氨基酸位点,探索H9N2亚型流感病毒变异的分子机制。【方法】将一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)在小鼠的肺脏进行传代,将小鼠解剖、摘除肺部、研磨离心后经滴鼻接种下一代小鼠,传播九代后,用MDCK细胞扩繁病毒,得到鼠肺适应株JN-P9-2-M1;扩增、克隆传代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因测序,推断各基因编码的氨基酸,与JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比对,得到各代次病毒核苷酸与氨基酸变化的位点;解剖小鼠,获得小鼠的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑和肠,滴定各组织中的病毒滴度,检测病毒的组织噬性;乙醚麻醉小鼠后,每个病毒稀释度鼻内接种3只小鼠,检测小鼠的幸存率和发病率;采集攻毒小鼠的肺部,固定后进行病理切片和免疫组化,比较JN原代病毒与JN-P9-2-M1对小鼠肺部的损害。【结果】JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,其MLD50为103.5EID50,106EID50、105EID50、104EID50攻毒剂量的小鼠幸存率是0,而原毒JN对小鼠不致死,JN-P9-2-M1对小鼠的致病性比原毒提高了至少1 000倍;攻入JN-P9-2-M1病毒剂量为106—103EID50的小鼠,体重明显减少,临床症状也很明显,攻毒后3—8 d,小鼠表现精神萎靡、被毛零乱、呼吸急促、弓背等症状,而原毒JN在106EID50时,小鼠的体重变化率都跟阴性对照组相似;JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受体结合特性相同,都是只能特异性结合SAa-2,6Gal受体,具有人样流感病毒
- 丁洁高玉伟桑晓宇程凯慧于志君张坤柴洪亮王铁成夏咸柱华育平
- 关键词：禽流感H9N2致病力
