倪海平
- 作品数：10 被引量：29H指数：3
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- 一种用RBSDV粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法
- 本发明公开了一种用RBSDV粗提液进行病毒覆盖蛋白结合实验的方法。本发明的实质是通过研磨RBSDV病样释放出病毒粒子，离心获得病毒的粗提液，以RBSDV的粗提液而不是提纯的病毒粒子进行病毒覆盖蛋白结合实验。本发明这个方法...
- 徐秋芳陈晴晴周益军倪海平
- 文献传递
- 灰飞虱actin基因的克隆及原核表达
- 2014年
- 通过生物信息学分析获得了灰飞虱actin基因的序列信息,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆了actin基因的开放阅读框,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。序列分析结果表明,该基因开放阅读框长1 131 bp,编码377个氨基酸,蛋白质理论分子量为4.17×104,理论等电点为5.28。将此序列登录GenBank数据库,登录号为KC683802。序列比对发现,该基因序列在多个物种间保守,与褐飞虱actin基因的同源性高达95%。构建的原核表达载体pET32a-actin,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行获得表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达的蛋白质主要存在于包涵体中。
- 陈晴晴李艳舞倪海平徐秋芳张金凤李硕周益军
- 关键词：灰飞虱肌动蛋白基因克隆原核表达
- 灰飞虱蛋白与RBSDV P10的互作分析
- 黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)为呼肠孤病毒科(Reoviri-dae)斐济病毒属(Fijivirus)的成员,可侵染水稻、玉米等禾本科植物,引起水稻黑条矮缩病、...
- 徐秋芳周益军陈晴晴倪海平李硕
- 关键词：灰飞虱酵母双杂交多克隆抗体
- RBSDV侵染对水稻ABA代谢相关基因表达的影响被引量：3
- 2015年
- 为明确水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)侵染对水稻脱落酸(abscisic acid,ABA)含量的影响,通过灰飞虱在水稻日本晴和淮稻5号两个品种上人工接种RBSDV,待接种的水稻表现明显矮缩症状时,采用ELISA方法测定ABA含量。结果显示,在接种RBSDV的日本晴和淮稻5号中,ABA含量均明显增加。接种病毒的日本晴植株中ABA含量为111.04ng/g,而对照中仅为60.86ng/g;淮稻5号对照植物ABA含量为70.61ng/g,而病株中ABA的含量为102.60ng/g。为进一步明确病毒侵染如何调控ABA的含量,采用荧光定量PCR方法分析了日本晴接种RBSDV 8d,12d,16d和60d时ABA合成关键基因(OsZEP、OsNCED1、OsNCED2、OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5)及分解关键基因(OsABA8ox1、OsABA8ox2和OsABA8ox3)mRNA相对表达量的变化。结果显示,病毒侵染8d,ABA合成和分解代谢基因的表达量均高于对照,其中OsNCED4和OsNCED5的表达量随病毒侵染时间的延长而增加,至60d时OsNCED3、OsNCED4和OsNCED5的表达量为对照的3.97、7.66和2.99倍,而OsZEP,OsABA8ox1和OsABA8ox2的表达量则随侵染时间的延长而降低。RBSDV侵染后可能既影响了ABA合成也影响了其分解,两者共同作用导致了ABA含量增加。
- 倪海平徐秋芳兰莹陈晴晴张金凤周益军
- 关键词：水稻黑条矮缩病水稻脱落酸基因表达
- 水稻幼苗酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定被引量：13
- 2018年
- 为解析水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)与寄主水稻的互作机制,筛选水稻中与病毒互作的蛋白,以易感RBSDV的水稻品种日本晴3~4叶期的组织样品为材料,通过提取总RNA后分离获得m RNA,合成cDNA双链后连入pDONR222载体,获得初级文库。初级文库的滴度为6.6×10~6CFU/mL,库容为1.9×10~7CFU,重组率>95%,插入片段平均长度>1 kb。提取初级文库质粒,通过重组反应将水稻cDNA文库转移至pGADT7-DEST载体,构建获得水稻幼苗的酵母双杂交cDNA文库,文库的滴度为4.5×10~6CFU/mL,库容为1.3×10~7CFU,重组率>95%,cDNA插入片段平均长度>1 kb。采用RBSDV候选基因进行文库筛选,结果表明所构建的酵母文库可用于筛选病毒互作蛋白。
- 朱佳慧徐秋芳袁平平倪海平周益军蒋选利杜何为
- 关键词：水稻酵母双杂交水稻黑条矮缩病毒滴度库容重组率
- 水稻黑条矮缩病毒P7-1基因对水稻的遗传转化及转基因植株的抗病性分析被引量：1
- 2018年
- 【目的】通过在水稻中过量表达水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)P7-1基因,分析RBSDV P7-1是否是导致水稻不育的重要致病因子,并明确过量表达P7-1转基因植株对病毒的抗性。【方法】采用RT-PCR方法从感病植物中扩增获得RBSDV P7-1基因,构建p CAMBIA-1300-P7-1载体,通过农杆菌转化法获得转基因水稻,观察水稻是否能够正常结实,并采用人工接种病毒方法分析转基因植株的抗性。【结果】过量表达RBSDV P7-1的转基因水稻生长、结实正常。在接种7 d和14 d时转基因植株中病毒积累量显著低于野生型对照,但在28 d时部分转基因株系中病毒积累量高于对照,接种30 d时转基因植株的发病率与对照无明显差异。【结论】在水稻中过量表达RBSDV P7-1不影响水稻的结实;转基因水稻在RBSDV侵染早期可抑制病毒的积累,但在后期对病毒的抗性与对照没有明显差异。
- 袁平平孙枫倪海平朱佳慧周益军蒋选利徐秋芳
- 关键词：水稻黑条矮缩病毒育性抗性评价
- 酵母双杂交筛选灰飞虱体内水稻黑条矮缩病毒p10的互作蛋白被引量：5
- 2013年
- 为获取灰飞虱体内传播RBSDV相关介体因子,以RBSDV编码的外层外壳蛋白p10为诱饵,采用酵母双杂交方法从灰飞虱cDNA文库中筛选与RBSDV p10互作的蛋白。将RBSDVp10基因构建至pGBKT7载体获得诱饵表达载体pGBKT7-p10。自激活实验结果表明,p10蛋白对酵母细胞无毒性,也不具有自激活活性。通过pGADT7-cDNA文库质粒转化含有pGBKT7-p10的酵母AH109筛选获得灰飞虱cDNA文库中与p10互作的蛋白。文库筛选共获得326个阳性克隆。测序结果表明这些阳性克隆编码14种不同的互作蛋白,包括Actin 1,GAPDH,RACK等。这些互作蛋白参与胞吞胞吐作用和膜融合等过程,可能与病毒在介体内的循回和增殖相关。
- 徐秋芳陈晴晴张金凤李硕倪海平周益军
- 关键词：水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白酵母双杂交
- 灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备被引量：8
- 2014年
- 【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)能与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因(Tm),将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框(open reading frame,ORF)。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a(+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经终浓度为0.4mmol·L-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol·L-1咪唑洗脱和0.01 mol·L-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a(+)表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合�
- 徐秋芳陈晴晴倪海平李硕张金凤周益军
- 关键词：灰飞虱原肌球蛋白克隆原核表达多克隆抗体
- 灰飞虱蛋白与RBSDV P10的互作分析
- 黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的成员,可侵染水稻、玉米等禾本科植物,引起水稻黑条矮缩病、玉...
- 徐秋芳周益军陈晴晴倪海平李硕
- 关键词：灰飞虱酵母双杂交多克隆抗体
- 灰飞虱蛋白与RBSDV P10的互作分析
- 黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）为呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）的成员,可侵染水稻、玉米等禾本科植物,引起水稻黑条矮缩病、玉...
- 徐秋芳周益军陈晴晴倪海平李硕
- 关键词：灰飞虱酵母双杂交多克隆抗体
