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家蚕微孢子虫蓖麻毒蛋白B链基因RBL463-4的克隆及在毕赤酵母中的表达被引量：1: 2010年; 基于家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)基因组中发现的蓖麻毒素B链(ricin B chain)序列数据设计引物,提取感染Nb第8天的家蚕幼虫中肠组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增出RBL463-4基因,并将其克隆进毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组酵母表达载体pPIC-R4。重组质粒pPIC-R4经SacⅠ线性化后,电击导入毕赤酵母X33中,利用博莱霉素(zeocin)筛选获得重组酵母X33/RBL463-4。以2%甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物,结果出现25kD和20kD2种蛋白,其中25kD蛋白与预测融合蛋白大小一致,表明获得了RBL463-4的融合蛋白。研究结果为进一步探究RBL463-4蛋白在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的功能作用奠定了基础。; 李能章潘国庆李田贾立丽邓远洪周泽扬; 关键词：家蚕微孢子虫毕赤酵母表达免疫印迹法

家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶基因的克隆及表达和亚细胞定位被引量：2: 2012年; 半胱氨酸脱硫酶是一类活性依赖于磷酸吡哆醛的酶类,可催化L-半胱氨酸转化为L-丙氨酸和硫烷硫原子,为铁硫簇组装提供硫原子。基于家蚕微孢子虫基因组数据,克隆了家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶(NbNfs)基因。序列结构分析显示NbNfs含有其活性所需的保守氨基酸位点,但不具有线粒体型N端导肽;系统发育分析表明微孢子虫半胱氨酸脱硫酶与真菌线粒体型半胱氨酸脱硫酶聚为一类,属于类群Ⅰ,起源于α-变形细菌;共线性分析表明半胱氨酸脱硫酶基因在不同微孢子虫之间其基因座位保守,具有共线性。构建重组质粒pET30a(+)-NbNfs,并转化到E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达NbNfs融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后,将融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blotting检测NbNfs在成熟家蚕微孢子虫具有表达。胶体金免疫定位显示NbNfs主要定位于成熟家蚕微孢子虫的细胞质中。研究结果为家蚕微孢子虫铁硫簇组装途径的研究奠定了基础。; 林立鹏潘国庆李田马成边茂飞党晓群罗洁邓远洪周泽扬; 关键词：家蚕微孢子虫基因克隆亚细胞定位

一个家蚕微孢子虫新基因的序列分析及蛋白质在酿酒酵母细胞中的定位被引量：1: 2013年; 微孢子虫具有基因组进化速度慢,但基因进化速度快的特征,不同微孢子虫间存在较多的共线性区域。通过比较基因组分析在家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)CQ1株中发现一个编号为NBO32g0035的功能未知新基因,而在兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)和蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)均无该基因的存在。该基因编码521个氨基酸,其中有131个酸性氨基酸和76个碱性氨基酸,赖氨酸含量最高,半胱氨酸有6个,SignalP3.0预测该基因编码的蛋白质无信号肽。采用RT-PCR方法在被N.bombycis CQ1株感染1～10 d的家蚕中肠组织中能检测到该基因转录活性,并且仅能在家蚕微孢子虫基因组中获得其克隆序列。对该基因的克隆测序表明其核苷酸序列具有多态性。通过转染单细胞模式生物——酿酒酵母检测发现,该基因编码的蛋白质不具有明显的亚细胞定位特征,主要分布在酿酒酵母细胞的细胞质中。研究结果表明这个家蚕微孢子虫新基因具有在感染初期表达、核苷酸多态性的特点,其编码蛋白质定位于酿酒酵母细胞的细胞质中。; 罗洁邓远洪黄为李田杨琼殷梅潘国庆李春峰周泽扬; 关键词：家蚕微孢子虫基因转录细胞定位

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究——家蚕微孢子虫Serpin蛋白NbSPN13的定位研究: 微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,能够感染从无脊椎动物到脊椎动物几乎所有的真核生物,包括重要的经济动物,如对虾、家蚕、鱼等,以及人类。在桑蚕养殖上微粒子病和带毒蚕种每年都会给我国...; 邓远洪; 关键词：家蚕微孢子虫亚细胞定位免疫荧光定位功能基因组

家蚕微孢子虫细胞分裂周期蛋白N端编码序列在酿酒酵母中的启动子活性分析被引量：1: 2011年; 微孢子虫(microsporidia)长期专性细胞内寄生,其基因组表现出显著的减缩性。利用家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)基因组数据库探究在其显著减缩的基因组中是否有编码序列发挥调控序列的作用,结果发现在DNA转录调控中发挥重要作用的细胞分裂周期蛋白(cell division cycle protein)的N端编码序列具有典型的真核生物启动子序列特征。设计引物扩增该基因N端590 bp包含启动子基序的序列(C启动子序列),将该启动子序列克隆到载体启动子(MET25-P)被终止序列(CYC1-T)替代的pUG35载体上,构建由该启动子序列启动下游绿色荧光蛋白(GFP)表达的克隆载体ΔpUG35-CYC1-T-C-yEGFP-CYC1-T,并将其电击转化酿酒酵母CEN.PK2菌株,经筛选及诱导培养后,在荧光显微镜下观察到酵母中有GFP表达,证实了家蚕微孢子虫细胞分裂周期蛋白的N端编码序列包含具有启动子活性的序列,表明家蚕微孢子虫基因组减缩后,部分编码序列可能扮演了调控序列的角色。研究结果也为微孢子虫启动子的活性验证提供了一个简便的途径。; 邓远洪李能章林立鹏潘国庆李田周泽扬; 关键词：家蚕微孢子虫启动子绿色荧光蛋白

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邓远洪