王生富
- 作品数：13 被引量：18H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪CD8α分子胞外区基因片段的原核表达
- 2010年
- 采用PCR技术从pGEM-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α胞外区去信号肽基因片段,并构建原核表达载体pET-30a-pCD8α-ED,在不同IPTG浓度和时间下进行诱导表达.结果表明:SDS-PAGE表达出约25ku的融合蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,IPTG最佳诱导浓度为0.5mmoL·L-1,诱导6h时表达量达到峰值;Western-blot结果显示,在25ku左右出现杂交条带,表明表达的融合蛋白能被抗HIS标签的单克隆抗体识别,说明目的蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.
- 崔青孙晓林王生富房永祥陈国华曾爽景志忠
- 关键词：原核表达
- 牦牛IFN-γ基因的表达及其产物的生物学活性分析被引量：2
- 2008年
- 用植物血凝素和脂多糖诱导牦牛外周血淋巴细胞,提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆了牦牛IFN-γ(YakIFN-γ)基因,然后设计了1对表达引物,从pGEM-YakIFN-γ载体上扩增YakIFN-γ成熟蛋白基因,将牦牛IFN-γ基因与表达载体pET-30a连接,构建了重组表达质粒pET-30-YakIFN-γ。用IPTG诱导表达的可溶性表达产物经镍柱亲和纯化,用纯化的重组YakIFN-γ蛋白进行了MTT、抑制肿瘤细胞增殖和细胞病变抑制的生物学特性研究。结果显示,成功克隆和表达了YakIFN-γ基因;序列分析表明:克隆的YakIFN-γ基因序列与GenBank上登录的黄牛IFN-γ基因序列的同源性为99.0%。SDS-PAGE分析和Western-blot检测证实,获得了高纯度的重组YakIFN-γ蛋白。重组YakIFN-γ(rYakIFN-γ)对伪狂犬病病毒的活性单位为2.2×103U/mg。表明表达并纯化的rYakIFN-γ蛋白具有较高的生物学活性和干扰病毒复制的活性。
- 王生富窦永喜陈国华贾怀杰房永祥景志忠
- 关键词：牦牛IFN-Γ基因生物学活性
- 猪CD8分子α链胞外区基因片段在毕赤酵母中的表达被引量：1
- 2010年
- 为了给猪CD8α分子单克隆抗体的研制提供高生物学活性的抗原,采用PCR方法从pGEM-T-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α分子的胞外区基因片段,构建了真核融合表达载体pPIC9K-pCD8α-ED,在毕赤酵母中进行表达,并对重组基因工程菌的发酵时间、pH值进行了优化。结果表明,表达出约20ku的目的蛋白,诱导表达的最适pH值为5.0,诱导表达的最佳时间是120h。Western-blot分析结果显示,表达产物能被鼠抗人CD8α多克隆抗体识别,在20ku左右出现目的条带,说明表达的目的蛋白具有免疫活性结构。
- 崔青王生富房永祥陈国华孙晓林景志忠
- 关键词：真核表达毕赤酵母
- 猪Toll样受体9基因的克隆、序列分析及其结构预测被引量：2
- 2009年
- 本研究应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增技术,从猪脾脏淋巴细胞中,克隆了猪Toll样受体9基因(pTLR9)。基因序列分析表明,克隆的pTLR9基因ORF为3 093 bp,编码1 030个氨基酸,含18.5%的亮氨酸,含有24个氨基酸的信号肽序列,属于Ⅰ型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LRR)和Toll/IL-1R同源区结构域;与GenBank上登载的pTLR9参考序列(AY859728)的同源性为99.3%,与牛、马、羊和人的同源性较高,与家鼠、褐鼠的次之,TLR9的演化关系与亲缘关系密切。
- 段凤云景志忠房永祥陈国华乔军王生富何延华
- 关键词：基因克隆生物信息学
- 牦牛IFN-β基因在毕赤酵母中的分泌表达
- 2010年
- 用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.
- 王生富孙晓林段风云何延华闫鸿斌景志忠
- 关键词：牦牛巴斯德毕赤酵母分泌表达
- 猪病原抗原免疫识别关键分子基因结构与多样性研究
- 机体获得性免疫主要与抗原递呈细胞(APCs)和T、B淋巴细胞上的许多免疫识别关键分子如MHC、T细胞受体(TCR)和CD4/8分子等密切相关,本研究以中国合作猪的这些分子为对象,在核酸水平分析其基因组、功能分子基因结构及...
- 景志忠莫斯科冯海燕李玩生王生富房永祥陈国华曾爽贾怀杰
- 关键词：合作猪T细胞受体
- 文献传递
- 牦牛IL-4基因的克隆及其遗传演化关系分析被引量：2
- 2008年
- 克隆牦牛白细胞介素-4（IL～4）基因，并对其进行遗传演化分析。从刀豆素（ConA）和脂多糖（LPS）联合刺激培养的牦牛外周血淋巴细胞提取总RNA．利用RT—PCR方法扩增牦牛IL-4全长cDNA，将其克隆到pMD18～T载体上，测序后进行序列分析。成功克隆到牦牛IL-4基因全序列，序列分析表明，克隆的牦牛IL-4基因序列与GenBank所登录的牛IL-4核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别这99．8％和100％，与人、猕猴、猪、山羊、马等物种的核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别在44．4％～96．3％和27．4％～91．1％之间。在国内首次成功地从牦牛外周血淋巴细胞中克隆到IL-4的基因，其ORF为408bp，推导编码135个氨基酸。
- 何延华房永祥陈国华段风云王生富李小庆景志忠
- 关键词：白介素4克隆牦牛
- 牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析被引量：4
- 2009年
- 为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200bp～1000bp之间。随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率。结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量。本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因。
- 何延华景志忠陈国华房永祥蒙学莲李小庆段风云王生富
- 关键词：抑制消减杂交CDNA文库
- 合作小型猪免疫识别和应答多样性与特异性分子遗传基础研究
- 机体免疫识别和应答主要与免疫细胞特别是抗原递呈细胞(APCs)和T淋巴细胞上的许多免疫识别和应答关键分子如参与天然免疫的TOLL样受体(TLR)以及参与获得性免疫的主要组织相容性复合物(MHC)、T细胞受体(TCR)和C...
- 景志忠房永祥李玩生莫斯科冯海燕王生富何小兵姚文娟陈国华曾爽贾怀杰
- 关键词：多样性特异性免疫遗传学
- 猪CD8β基因的克隆、表达及其结构与功能分析被引量：6
- 2008年
- 本研究应用RT-PCR技术,从猪胸腺细胞总RNA中扩增、克隆了猪CD8β基因,序列分析表明CD8β含621bp的开放阅读框,编码207个氨基酸,与NCBI/GeneBank已发表的参考基因的核苷酸及推导氨基酸序列的同源性分别为97.8%和96.8%,与人、小鼠和鸡CD8β蛋白的氨基酸同源性分别为75.7%、67.9%和33.3%。根据大肠杆菌密码子偏嗜性改造目的基因,构建了pET28a/PCD8β原核表达系统,并经诱导获得高效表达的分子量为24ku的重组蛋白(rPCD8β),表达量占菌体蛋白总量的30%。利用生物信息学和分子生物学软件对猪CD8β基因编码的蛋白进行结构预测,表明猪CD8β成熟蛋白为跨膜蛋白,其中172aa在胞外区,22aa在跨膜区,10aa在胞内区;蛋白骨架内含有较多的柔性区域,而且分布不均匀,能形成结构松散的球状蛋白;猪CD8β分子V区三维结构与鼠的具有非常相似的空间结构,与人的差别较大,这为猪CD8β蛋白结构与功能的进一步研究奠定了基础。
- 王生富景志忠陈国华房永祥莫斯科段凤云何延华
- 关键词：Β基因克隆
