常东英
- 作品数：8 被引量：7H指数：2
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- 重组戊型肝炎疫苗菌种库的建立及其稳定性被引量：1
- 2012年
- 目的建立重组戊型肝炎疫苗工程菌三级种子库,并分析其稳定性。方法将工程菌株HEV179/BL21(DE3)复苏活化,经全面检测合格后冻干保存即为原始种子库;原始种子库传代扩增,经全面检定合格后,冻干保存即为主种子库;主种子库经传代扩增和全面检定合格后,甘油冻存即为工作种子库。对三级种子库进行全面检定,并对工程菌进行冻干及甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性检测。结果建立的三级种子库经全面检定合格;菌种冻干稳定性、甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性指标均合格,菌种生长特性、遗传和表达稳定性均未发生变化。结论成功建立了HEV179/BL21(DE3)工程菌三级种子库,菌种稳定性良好,适用于重组戊型肝炎疫苗的工业化生产。
- 曹玉锋徐军时成波孟多佳迟春萍王玉梅贾媛张剑锋常东英王伟善
- 关键词：疫苗种子库稳定性
- 一种铜锌超氧化物歧化酶突变体的原核表达、纯化及酶活性测定
- 2020年
- 目的原核表达、纯化一种铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)突变体,并检测其酶活性。方法将经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体基因亚克隆至pET-28a载体中,构建重组表达质粒SOD1-pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达;在500 mL摇瓶培养条件下,通过改变加入Cu、Zn离子的量优化诱导表达条件;表达的重组蛋白经初步纯化后,测定酶活性。结果重组表达质粒SOD-pET-28a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为15000,主要以可溶性形式表达;工程菌株在500 mL摇瓶培养条件下培养至10 h左右,A600至3.5左右时加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG、0.2 mmol/L ZnCl2、0.5 mmol/L CuSO4,可获得最佳表达量(29.2%);初步纯化获得的重组蛋白纯度为97.32%,比活为5.08×103U/mg。结论成功利用大肠埃希菌表达系统表达了一种经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体,初步纯化的突变体具有较好的酶活性,为进一步摸索大规模生产工艺及实际应用奠定了基础。
- 唐剑光张健锋常东英曹玉锋乔宏雷高洪喜迟春萍
- 关键词：铜锌超氧化物歧化酶原核表达层析酶活性
- 表达长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的CHO细胞培养工艺的优化及放大
- 2020年
- 目的优化表达长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的CHO细胞培养工艺,并进行初步工艺放大。方法采用7 L生物反应器培养表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞,操作参数:转速200 r/min,温度37℃,pH 7.2±0.1,溶氧值(DO)40%。通过改变对数增长期的pH(7.2±0.1降至6.9±0.1)及平台期降温幅度(37℃降至30及33℃),检测培养过程中细胞密度、细胞活率、培养液渗透压、葡萄糖及乳酸水平、以蛋白表达量为指标,优化7 L生物反应器培养工艺。应用优化的最佳工艺进行14 L线性放大,通气量分别设置为0.5、0.1及0.03 SLPM,检测蛋白表达量。结果7 L生物反应器培养工艺最佳pH为6.9±0.1,最佳温度为33℃,该工艺下蛋白表达量高达1200 mg/L;14 L生物反应器培养工艺最佳通气量为0.03 SLPM,该工艺下蛋白表达量为880 mg/L。结论成功优化了表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞7 L生物反应器的培养工艺,并实现了14 L生物反应器的放大,本实验为后续rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了基础。
- 薛毅勇许佳慧俞露富瑞丽王莹刘玉林常东英刘涵
- 关键词：重组人生长激素FC融合蛋白CHO细胞生物反应器
- HEV ORF2截短融合蛋白的原核表达及其免疫原性
- 2020年
- 目的原核表达3型戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)第2个开放阅读框(open reading frame 2,ORF2)截短融合蛋白(HEV3-179-Fe),并检测其免疫原性。方法分别扩增HEV3-179和Fe蛋白基因片段,经Overlap PCR法连接并扩增,克隆至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-HEV179-Fe,将其转化感受态E.coli BL21(DE3),取阳性菌株,IPTG诱导表达融合蛋白HEV3-179-Fe,进行10%SDS-PAGE分析。目的蛋白经镍离子金属鳌合亲和层析纯化后,加入硫酸铵进行病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)重构,置电镜下观察。HEV3-179-Fe蛋白VLPs与氢氧化铝佐剂吸附后免疫小鼠,ELISA法测定效价,以评价HEV ORF2截短融合蛋白的免疫原性。结果重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe构建正确。目的蛋白HEV3-179-Fe相对分子质量约40000,主要以包涵体形式存在,表达量均达35%以上,纯度约95%,可与鼠抗HEV 3多抗发生特异性反应。硫酸铵重构后于电镜下可见直径约20 nm的VLPs,其免疫小鼠的血清效价达1∶4800000以上。结论原核表达了HEV3-179-Fe,且在小鼠体内具有较好的免疫原性。本实验为以HEV ORF2-179蛋白为基础的VLPs基因工程疫苗的研发奠定了基础。
- 周永飞乔宏雷赵丹莹唐剑光常东英韩顺子常军亮张健刘玉林曹玉锋
- 关键词：戊型肝炎病毒基因重组原核表达免疫原性
- 重组戊型肝炎疫苗抗原P179表征分析被引量：2
- 2016年
- 目的对重组戊型肝炎疫苗（recombinant hepatitis E virus,rHEV）抗原P179表征进行分析。方法取3批HPLC及电泳纯度均为100%的rHEV抗原P179原液,采用SDS-PAGE法检测相对分子质量及二聚体含量;OPA-FMOC全自动柱前衍生-Amino Quant氨基酸分析法测定氨基酸组分;电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱（electrospray ionizationquadrupole time-of-flight-mass spectrometry,ESI-Q-TOF2-MS）法分析C-末端、Edman降解法测定N-末端氨基酸序列;HPLC法进行肽图分析;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;圆二色光谱仪分析其二级结构;透射电镜负染法观察蛋白颗粒状态;双抗体夹心ELISA法检测抗原活性。结果 3批rHEV抗原P179相对分子质量在17 500-21 300之间;二聚体占总蛋白的85%以上;氨基酸组分、C-末端氨基酸序列、N-末端氨基酸序列、肽图、等电点等均与预期相符;3批rHEV抗原P179二级结构中,α螺旋4.8%-5.6%,β折叠34.8%-36.4%,β转角20.8%-22.2%及无规卷曲37.7%-38.0%;透射电镜观察可见大小均一,粒径约20 nm的蛋白颗粒;抗原活性比值在5.0×10^5-2.0×10^6CCU/mg范围内。结论 3批r HEV抗原P179结构特征均一,与设计相符,为该疫苗的产业化奠定了基础。
- 迟祥李铮贾媛唐剑光宋昊陈子杨常东英迟春萍
- 关键词：戊型肝炎疫苗抗原
- 重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化被引量：3
- 2016年
- 目的原核表达重组汉滩型病毒（Hantaanvirus，HTNV）核蛋白（recombinant HTNV nuclear protein，rHTNNP）和重组汉城型病毒（Seoulvirus，SEOV）核蛋白（recombinant SEOV nuclear protein，rSEONP），并进行纯化。方法从HTNVPS-6株和SEOVL-99株灭活病毒液中提取总RNA，依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物，用逆转录PCR法扩增此S基因片段，构建原核表达质粒pET-Trx-his—HTNNP和pET-Trx-his—SEONP，并在大肠埃希菌中诱导表达。表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后，用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性。结果重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确。表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26000，表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％，主要以可溶性形式表达，且纯度可达约70％。双向免疫扩散试验证实，这2种重组蛋白具有较好的抗原性。结论成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒，并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP，为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础。
- 常东英张健锋吴菲王玉霞王振萍迟祥贾媛曹玉锋陈子杨刘国瑞唐剑光时成波
- 关键词：汉坦病毒属基因表达质粒纯化
- 森林脑炎病毒包膜E蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性初步评价被引量：2
- 2020年
- 目的原核表达及纯化森林脑炎病毒(tick-bome encephalitisvirus,TBEV)包膜E蛋白,并初步评价其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增TBEV E蛋白基因,克隆至载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pET-28a-TBEV E,转化感受态E.coli BL21(DE3),挑取阳性克隆,扩增后经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导,表达产物经12%SDS-PAGE及Western blot鉴定。将鉴定正确的重组蛋白采用镍柱亲和法纯化,铝佐剂吸附后,经小鼠左侧腹腔注射,0.5 mL/只,间隔1周加强免疫1次,末次免疫后7、14、21、28、35、42、49 d,经小鼠眼眶采血,分离血清,ELISA法测定小鼠血清抗体水平。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-TBEV E构建正确。表达产物相对分子质量约55000,主要以包涵体形式表达,表达量约22.3%,且可与小鼠抗TBEV血清发生特异反应,纯化后纯度达90%。末次免疫后21 d,小鼠血清抗体效价达最高,为1∶6400。结论经原核表达系统成功表达并纯化了TBEV E蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,本实验为TBEV诊断制剂及基因工程疫苗的研发奠定了基础。
- 邴振虹王兰菊周永飞常东英张健锋王伟韩顺子常军亮孙宏亮曹玉锋邹勇
- 关键词：森林脑炎病毒基因重组原核表达免疫原性
- 人胰岛素样生长因子-1的融合表达及纯化
- 2013年
- 目的利用原核表达系统融合表达人胰岛素样生长因子-1(human insulin-like growth factor-1,hIGF-1),并进行纯化及鉴定。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对hIGF-1天然基因序列进行同义突变,并人工合成,PCR扩增后,克隆至pET48b(+)载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白Trx A-hIGF-1经Ni2+亲和层析进行纯化,纯化产物经肠激酶酶切后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET48b-Trx A-hIGF-1经菌落PCR及测序证实构建正确;表达融合蛋白相对分子质量约为26 000,表达量约为菌体总蛋白的40%,主要以可溶形式存在于菌体裂解上清中,可溶性蛋白占总目的蛋白的比例不低于90%,纯化后纯度不低于90%,蛋白浓度为0.5 mg/ml;纯化的Trx A-hIGF-1融合蛋白可被肠激酶切割为相对分子质量约为8 000的hIGF-1蛋白和18 000的Trx A蛋白,hIGF-1蛋白可与兔抗hIGF-1多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了hIGF-1融合蛋白,为其生物学活性的研究及规模化生产奠定了基础。
- 曹玉锋李霄培陈子杨王健常东英贾媛张健锋吴菲王伟善时成波
- 关键词：胰岛素样生长因子-1融合蛋白原核细胞基因表达
