张成海
- 作品数：13 被引量：55H指数：4
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- rhIFN-β1a cDNA在CHO细胞上的表达
- 2004年
- 目的 在CHO细胞上表达rhIFN βcDNA。 方法 利用脂质体技术 ,将含hIFN β基因的pRC CMV IFNβ DNA载体和pSV2dhfr DNA质粒按 3∶1的比例转染CHO k1dhfr 细胞 ,后者是选择性标记。筛选在缺乏胸腺嘧啶的选择培养基生长的单个细胞克隆 ,通过MTX加压扩增与dhfr基因共转染IFNβ基因。筛选的细胞株通过大规模培养 ,收集培养液经一系列的步骤纯化。结果 能够耐受 0 .6 μmol LMTX的细胞可产生IFN 10 5unitperday 10 6cells ,CHO细胞中表达的hIFN β纯化后的抗病毒比活性可达 2 .2× 10 8IU mg。结论 建立了适合表达人干扰素
- 李武平衣作安张成海王刚郑丽舒段招军吕宏亮侯云德
- 关键词：干扰素卵巢细胞
- 革兰氏阳性细菌表面显示技术及其应用
- 2004年
- 本文概述了革兰氏阳性菌表面显示技术的基本原理、开发研究的热点载体和菌株及其应用前景 ,并与其它表面显示系统进行比较 。
- 衣作安张成海李武平
- 关键词：革兰氏阳性细菌菌株
- 重组人干扰素-β(rhIFN-β)中试工艺研究被引量：2
- 2004年
- 目的 建立适合大规模生产重组人干扰素 β(rhIFN β)的分离纯化工艺。 方法 采用超声破菌、离心分离包涵体、仲丁醇萃取、Sephacryl 10 0、HIC层析等分离纯化步骤。结果 纯化的rhIFN β纯度达 98%以上 ,比活性为 2 .0× 10 7IU/mg,各项质量指标均符合质控标准。结论 此纯化工艺简便 ,可重复性好 ,适于大规模生产。
- 李武平宋瑜丽张成海衣坐安吕洪亮段招军侯云德唐旭东
- 关键词：纯化糖蛋白
- 脑啡肽-干扰素α-m融合蛋白外用治疗单纯疱疹病毒感染被引量：1
- 2002年
- 为探讨脑啡肽 -干扰素α -m融合蛋白 (EI)外用治疗单纯疱疹病毒感染的作用 ,分别用HSV - 1感染兔子角膜、HSV - 2感染豚鼠阴道建立动物感染模型。兔子角膜感染 2 4h后用融合蛋白滴眼液治疗 ,每天 3次 ,每次0 5ml,共 14天。豚鼠阴道感染 4 8h后 ,用融合蛋白涂剂抹外阴病灶 ,每天 3次 ,每次 10mg ,共 14天。用IFNα -m和生理盐水 /赋形剂作为对照。采用记录病损程度分级法进行临床症消减观察 ,并于治疗前后测定实验动物病灶病毒滴度、HSV抗体滴度及NK细胞活性。结果显示 :与IFNα -m相比 ,EI治疗组实验动物病毒感染症状大幅减轻且病程缩短 ,动物病灶中病毒滴度下降 ,抗HSV抗体滴度升高 ,NK细胞活性增强。说明脑啡肽干扰素融合蛋白具有较强的消除炎症和局部抗病毒作用 。
- 吕宏亮李武平张成海马超王玉淋邹勇衣作安陈勇吴斌文段招军侯云德
- 关键词：脑啡肽融合蛋白外用单纯疱疹病毒感染
- 新型重组人IFN-λ2的高效表达、纯化与抗病毒活性研究被引量：6
- 2005年
- 目的在大肠埃希菌中高效表达重组人干扰素λ2(rhIFNλ2),并对其抗病毒活性进行初步研究。方法根据大肠埃希菌的偏爱密码子人工设计合成人干扰素λ2(hIFNλ2)的高表达基因,将其克隆到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌中进行表达,表达产物经变性、复性、阳离子交换层析及分子筛层析纯化,测定其抗病毒活性、种属特异性及抗HBV活性。结果在大肠埃希菌表达的目的蛋白占细胞总蛋白量的15%左右,纯化后的纯度达到90%以上,在WISH细胞上抗VSV活性约为1.5×106IU/mg。与rhIFNα2b比较,表达产物在非灵长类细胞上的抗病毒活性较在灵长类细胞上弱,目的蛋白在HepG2.2.15细胞上表现有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性。结论hIFNλ2可以在大肠埃希菌内实现高效表达,表达产物具有抗病毒活性,有与rhIFNα2b相似的抗HBV活性,本型IFN有较严格的种属特异性。
- 王刚李武平张成海衣作安郑丽舒张辉段招军侯云德
- 关键词：干扰素类层析纯化HEPG2.2.15细胞IFN抗HBV活性
- 幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因(ureI)的克隆及其表达和纯化被引量：1
- 2004年
- 目的 对幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因ureI进行克隆、测序 ,并在昆虫细胞中表达及进行产物纯化。方法 克隆ureI基因 ,经测序正确后 ,酶切、连接到pFASTBACHb质粒上 ,与穿梭载体DH10BAC转座 ,获得Bacmid ureI质粒 ,转染Sf9细胞 ,采用Ni2 +螯合琼脂糖亲和层析纯化 ,经SDS PAGE和Westernblot鉴定。结果 克隆了ureI基因 ,并在昆虫细胞Sf9中表达纯化 ,蛋白纯度达 85 %以上 ,并与 6 His单抗特异结合。
- 衣作安李武平张成海高建梅王刚段招军侯云德
- 关键词：幽门螺杆菌基因克隆昆虫细胞纯化
- 不同型别重组人干扰素在细胞培养上抗SARS病毒的研究被引量：18
- 2003年
- 目的 研究重组人干扰素α2b、α1b、β1b和ω1b对严重急性呼吸综合征 (SARS)病毒在细胞培养上的抑制作用。方法 采用细胞病变抑制法在人横纹肌瘤 (Rda)细胞系培养上测定干扰素的抗SARS病毒活性。结果 高度纯化的重组人干扰素α2b、α1b、β1b和ω1b在Rda细胞培养上抑制SARS病毒产生 5 0 %细胞病变 (CPE)的最小活性单位各为 (16 0 5± 12 9 5 )IU ml、(14 9 0± 71 7)IU ml、(6 9 5± 6 1 5 )IU ml、(87 3± 4 7 1)IU ml或各为 (0 6± 0 5 )ng ml、(10 6± 5 1)ng ml、(3 5± 3 1)ng ml、(0 9± 0 5 )ng ml。结论 本研究中所用的重组人干扰素在细胞培养上均具有较好的抑制SARS病毒的活性。
- 段招军张丽兰谢志萍喻志爱张丽萍张滨刘永清王健伟李武平张成海马学军舒跃龙段淑敏李德新侯云德
- 关键词：重组人干扰素细胞培养SARS病毒免疫机能
- 人干扰素ω(huIFN-ω)的高效表达、纯化及生物学活性被引量：4
- 2004年
- 为了获得人干扰素 ω(huIFN ω)在大肠杆菌中的高效表达,根据大肠杆菌的偏爱密码子,人工设计并合成了huIFN ω高表达基因,并克隆到原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达,目的蛋白占细胞总蛋白的15%左右,以包涵体形式存在。表达产物经变性、复性及阳离子和分子筛层析纯化,纯度达90%以上,产物的抗病毒活性约为1.0×108IU/mg,并具有体外促NK杀伤活性。此结果为进一步研究和开发重组huIFN ω奠定了基础。
- 张成海李武平衣作安王刚吕宏亮段招军侯云德
- 关键词：纯化大肠杆菌包涵体
- 人角质化细胞生长因子2基因克隆、表达及其产物的纯化和鉴定(英文)被引量：2
- 2006年
- 背景:人角质化细胞生长因子2具有广泛的生理功能,在胚胎发育、组织的修复、神经的再生、血管的生成和肿瘤发展中具有重要作用。目的:克隆人角质化细胞生长因子2基因,于大肠杆菌中表达,并检测其生物学活性,为进一步开发提供实验依据。设计:开放性实验。单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。材料:实验于2000-09/2002-05在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室完成。pBV220温控表达载体为病毒基因工程国家重点实验室构建,EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶(Promega公司);人角质化细胞生长因子2特异性聚合酶链反应引物(上海博亚生物技术有限公司合成);肝素-SepharoseCL-6B(Pharmacia公司);快速聚合酶链反应产物纯化试剂盒、总RNA提取Trizol试剂盒、反转录-聚合酶链反应试剂盒(GIBCO公司);质粒DNA快速提取试剂盒(博大公司);BL-21-codonpluscompentcells(Stratagene公司)。方法:用高表达菌株BL-21-codonpluscompententcells表达重组人角质化细胞生长因子2蛋白并初步纯化和检测其活性。通过反转录-聚合酶链反应从自然流产胎儿肺组织中钓取人角质化细胞生长因子2cDNA,将其克隆入pBV220载体质粒。在大肠杆菌BL-21-codonpluscompentcells中表达人角质化细胞生长因子2蛋白。采用亲和层析和离子交换层析分离纯化,以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性。主要观察指标:人角质化细胞生长因子2cDNA的片段长度和序列,人角质化细胞生长因子2基因在大肠杆菌中的表达,纯化人角质化细胞生长因子2的活性。结果:人角质化细胞生长因子2cDNA片段大小约500bp,人角质化细胞生长因子2蛋白在BL-21中得到高效表达,于上清中可溶性表达,SDS-PAGE显示相对分子质量约20000;人角质化细胞生长因子2蛋白对NIH3T3细胞具有显著的促有丝分裂活性,1,5,10μg/L人角质化细胞生长因子2A值(
- 吴斌文段招军李武平陈勇吕宏亮衣作安张成海林菊生王家侯云德
- 关键词：角蛋白细胞基因表达
- 幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定被引量：2
- 2005年
- 目的 克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法 采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果 所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论 成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。
- 郑丽舒衣作安李武平张成海王刚侯云德
- 关键词：幽门螺杆菌HPAA基因粘附素克隆IPTG
