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肝片吸虫组织蛋白酶L基因的克隆、表达和免疫原性分析(英文)被引量：2: 2009年; 目的克隆和表达肝片吸虫组织蛋白酶L基因(FhCL),分析其免疫原性。方法根据GenBank公布的FhCL基因序列设计引物,以肝片吸虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增FhCL基因编码序列,PCR产物经TA克隆,通过EcoRⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定获得重组质粒pMD18-T/FhCL,并将其亚克隆入原核表达载体pET30a(+),经PCR,以及BamHⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定,构建原核表达质粒pET30a(+)-FhCL,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并获得纯化的重组蛋白FhCL,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,以及蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组蛋白对感染肝片吸虫的山羊血清及免疫的SD大鼠血清的免疫反应性。结果PCR和BamHⅠ、HindⅢ双酶切均可见约1000bp的条带,测序结果显示重组质粒pET30a(+)-FhCL构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为Mr42000(含6个组氨酸标签),与目的蛋白相符,以包涵体形式表达。Westernblotting分析结果显示,纯化的重组蛋白FhCL可被感染肝片吸虫的山羊血清和免疫的SD大鼠血清识别,在目的条带Mr42000处见单一特异性条带,而阴性对照血清则无反应带。结论克隆及表达了肝片吸虫组织蛋白酶L编码基因,重组蛋白具有良好的免疫原性。; 李晓娟闻晓波冉旭华李树东王春仁朴范泽; 关键词：肝片吸虫克隆原核表达

表面展示新城疫病毒部分F蛋白的重组干酪乳杆菌的构建及其免疫原性被引量：4: 2019年; 本研究旨在构建重组干酪乳杆菌pLA-Newcastle disease virus (NDV)-F/Lactobacillus casei,获得表达产物,并探讨其免疫效果。利用PCR扩增携带部分主要抗原表位的NDV F基因,与穿梭质粒pLA连接转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,筛选阳性重组质粒,将其电转化至干酪乳杆菌中,构建重组干酪乳杆菌pLA-NDV-F/L. casei,应用PCR鉴定阳性菌株,Western blotting鉴定重组菌反应原性,间接免疫荧光、流式细胞术和激光共聚焦检测蛋白表达情况。试验选用14日龄雏鸡,各组免疫方式为口服+滴鼻。设立pLA-NDV-F/L. casei两次免疫组和三次免疫组、弱毒疫苗组、pLA/L.casei、未攻毒PBS组和攻毒PBS组。间接ELISA方法检测雏鸡血清IgG、肠道、鼻腔、肺脏中sIgA抗体效价,评价试验组雏鸡攻毒保护率。结果表明,有94.10%的重组菌表达了F蛋白,且高效表达在干酪乳杆菌细胞表面,蛋白大小为62 kDa,并能与抗NDV阳性血清特异性结合。各免疫组anti-F IgG和sIgA抗体水平显著高于对照组,pLA-NDV-F/L. casei三次免疫组抗体持续时间比两次免疫组延长28 d,抗体峰值没有显著差异。免疫pLA-NDV-F/L. casei三次、两次、弱毒疫苗、pLA/L. casei和PBS的攻击保护率分别为80%、80%、90%、0%和0%。因此,利用干酪乳杆菌表达体系成功表达了携带部分抗原表位的NDV F基因,具备良好的反应原性和免疫原性,可诱导机体产生保护性免疫应答。; 刘欢欢李树东杨雨晴孙晓莹李岩刘昕旸陈小燕张连妹白永飞侯喜林余丽芸; 关键词：新城疫病毒免疫原性干酪乳杆菌黏膜免疫保护率

猪轮状病毒感染小鼠肠道组织的转录组分析: 2023年; 猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)是在世界范围内与严重腹泻疾病相关的主要肠道病原体,是新生仔猪肠炎和腹泻致死的重要原因之一。为了深入了解猪轮状病毒感染肠道后其致病机制以及引起宿主的抗病毒和修复机制,我们分别饲喂培养基和猪轮状病毒病毒液5d后,采取5 d、10 d、15 d、20 d、25 d小鼠空肠组织进行高通量转录组测序分析。利用基因本体论(Gene Ontology,GO)数据库功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析差异表达基因(Differentially Expressed Gene,DEGs),选取部分差异表达基因,进行qRT⁃PCR验证。结果显示,与对照组相比,5个时间段上调DEGs有849个,下调DEGs有824个。对DEGs进行5个功能富集,有共同差异基因15个。这些差异表达基因广泛参与脂质合成与代谢、免疫、细胞增殖、细胞凋亡等活动,主要注释到PPAR、NOD⁃like、IL⁃17等信号通路中。qRT⁃PCR验证上皮细胞增殖相关基因PBLD、CCL24、Nr1d1、Fst表达趋势与RNA⁃seq结果趋势一致。此分析提示PoRV感染小鼠肠上皮细胞后可能通过细胞增殖相关基因的高表达或其信号通路的激活进行受损的肠上皮的修复。; 李颖李树东秦达曲艺程荣叶侯喜林余丽芸; 关键词：猪轮状病毒差异表达基因

猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析被引量：5: 2010年; 为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。; 闻晓波李冬野李树东冉旭华李晓娟邵磊王密朴范泽杨焕民侯喜林倪宏波; 关键词：猪圆环病毒2型 ORF2

重组干酪乳杆菌喷雾干燥制剂制备工艺的优化: 2020年; 目的优化重组干酪乳杆菌喷雾干燥制剂的制备工艺。方法以乳清蛋白为悬浮基质与重组干酪乳杆菌混匀,进行喷雾干燥,通过单因素试验确定乳清蛋白的添加量(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)及进风温度(60、80、100、120、140、160、180℃)、给气量(65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%)和进料速度(2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mL/min)等喷雾干燥工艺参数;以活菌数和存活率为指标,通过正交试验进一步优化工艺参数。同时检测最适工艺制备的重组干酪乳杆菌喷雾干燥制剂的质量指标和贮藏稳定性。结果最适乳清蛋白添加量为20%,最适工艺参数:进风温度为120℃,给气量为75%,进料速度为10 mL/min。喷雾干燥制剂相关的质量指标均符合要求,在4℃真空条件下贮藏稳定性最好。结论优化了重组干酪乳杆菌喷雾干燥制剂的制备工艺,为其产业化生产奠定了基础。; 张连妹陈小燕白永飞李颖蔡昌福李树东刘欢欢李岩孙晓莹杨雨晴侯喜林余丽芸; 关键词：喷雾干燥工艺参数正交试验

流产胎猪鲍曼不动杆菌的分离鉴定被引量：5: 2017年; 为确诊黑龙江省某种猪场母猪发生的严重流产的病原,选择2头刚流产的胎儿剖检并无菌采取病料,结果从胎儿的肝、脾和肺组织中检测出PRV和PRRSV核酸阳性,同时还分离到1株革兰阴性细菌,对其理化特性进行鉴定,并对其进行16S r RNA测序分析。结果显示,该菌与鲍曼不动杆菌理化特性相符,并与菌株DENMARK 1O的同源性为99.2%,所以确定该菌为鲍曼不动杆菌,并命名为HLJ-1。; 高国强李树东王珊珊刘欢欢周玉龙侯喜林; 关键词：鲍曼不动杆菌细菌分离流产胎儿生化鉴定系统进化分析

肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆表达及活性分析被引量：5: 2009年; 目的克隆和表达肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因(FhGST)以研究重组蛋白免疫学特性。方法参考Gen-Bank上发表的FhGST基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR法扩增FhGST基因,将扩增产物克隆入pET-30a(+),构建重组表达载体。经PCR、双酶切和序列测定鉴定后转入E.coliBL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对该重组蛋白进行分析和鉴定。结果成功获得肝片吸虫GST基因全长为657bp的编码序列,SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量为31.3kDa,以包涵体形式表达。Western blotting结果证实重组蛋白能被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能与感染肝片吸虫的绒山羊血清发生反应,表明重组蛋白具有免疫反应性。结论成功的克隆了肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因,实现了在原核表达系统中高效表达重组蛋白,并具有良好的免疫学活性。; 冉旭华李晓娟李树东王春仁朴范泽闻晓波; 关键词：肝片吸虫原核表达

HA和NA匹配度对H5亚型高致病性禽流感假病毒影响的研究: 2023年; 为研究不同H5亚型高致病性禽流感病毒(H5 HPAIV)的HA和NA匹配度对流感假病毒组装和功能的影响,本研究将5株H5 HPAIV的HA和NA基因节段分别克隆于pCMV/R载体,构建3个HA和5个NA重组质粒,两两随机组合后将HA、NA质粒与pCMV/RΔ8.9质粒、p HR-CMV-Luc质粒构成4质粒系统,利用磷酸钙法将4个质粒转染HEK293T细胞,检测各细胞培养上清液血凝效价,结果显示:有3个上清液无血凝效价,其余12个上清液的血凝效价在100 HAU/m L~400 HAU/m L,表明获得12株具有血凝效价的流感假病毒。超速离心后获得浓缩假病毒,通过western blot检测假病毒HA蛋白的表达,结果显示各假病毒均在75 ku、50 ku和25 ku有特异性条带。利用各假病毒分别感染MDCK.1细胞60 h后裂解细胞,采用荧光素酶试验检测假病毒的相对荧光素酶活性(RLA),结果显示各假病毒RLA在5.0×10~1~4.5×10~5不等。上述结果首次表明不同H5 HPAIV的HA和NA相互匹配会对假病毒的血凝效价和相对荧光酶活性(RLA)造成影响。本研究为后续流感病毒灭活疫苗制备及抗病毒药物的研发奠定基础。; 李涵冰李树东常小艳杨学莲侯喜林王桂芹余丽芸; 关键词：假病毒 HA NA

检测PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法的建立被引量：6: 2008年; 用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达PRRSV重组N蛋白作为包被抗原,建立检测猪群PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法,并对临床上采集的256份猪血清样本进行检测,结果66份呈阳性,用IDEXXPRRSV抗体检测试剂盒检测,检出的阳性血清为63份,两者的符合率为98.8%。Western blot检测结果58份阳性,两者的符合率为96.9%。试验结果表明,本试验所建立的间接阻断ELISA方法具有良好敏感性和特异性,可用于PRRS流行病学调查和疾病的诊断。; 冉旭华赵喜红闻晓波倪宏波李树东周恩民; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白流行病学调查

干酪乳杆菌刺激小鼠肠道的转录组学分析: 2023年; 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)刺激小鼠肠道后,利用高通量测序技术对干酪乳杆菌饲喂组和空白组小鼠的肠道组织进行分析,以期查询和验证干酪乳杆菌对肠道免疫的影响。转录组数据的生物信息学分析发现差异表达基因共751个,通过GO富集分析发现有14个基因与细胞免疫相关,聚焦在T细胞激活、细胞分化、免疫调节负调控等功能上。KEGG通路富集显示聚集在PPAR信号通路、B细胞受体信号通路和趋化因子信号通路。对基因的基本特性分析结果显示,14个基因分别定位在10条染色体上,蛋白的分子量介于11.37~83.45 kDa之间,等电点pI 4.42~11.36,均为不稳定脂溶性蛋白,并具有相关功能结构域。通过保守基序与结构分析发现Motif分布具有保守性,大部分基因含有2个内含子。qRT-PCR验证结果表明,14个基因中有6个基因(Ces1d、Lzts1、Paqr7、Aloxe3、Zbtb16、OX40)在不同时间的处理下整体表达水平较高。验证结果与转录组测序结果一致,且这些基因功能与细胞免疫相关,该结果为研究干酪乳杆菌对机体的免疫作用效果提供一定的理论依据。; 程荣叶李树东秦达杨启尧李颖余丽芸侯喜林; 关键词：干酪乳杆菌肠道生物信息学基因表达

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李树东

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