为了观察A-Raf的突变体A-Raf-S214C对MAPK(mitogen-activated protein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)信号通路的影响,并探讨其诱发肺癌和朗格汉斯增生症的可能分子机制。通过定点突变构建pc DNA5-FRT-TO-A-Raf-S214C突变质粒,并利用该质粒构建稳定表达A-Raf-S214C突变体的HEK293细胞系,之后通过检测下游ERK磷酸化程度,确定该突变体对MAPK信号通路的影响。结果显示,通过实验成功构建了稳定表达A-Raf-S214C突变体的细胞系,在不同浓度的多西环素诱导下,其表达量有所不同。与野生型相比,A-Raf-S214C突变体可明显增强MAPK信号通路中下游信号分子ERK的磷酸化。结果表明A-Raf-S214C突变体是A-Raf激酶的激活突变体,可以导致MAPK信号通路下游信号分子ERK磷酸化明显增强。
该文通过RNA干扰方法下调染色体结构维持蛋白3(structural maintenance of chromosomes protein 3,SMC3)的表达,探究其对人肺癌细胞A549的影响。用Western blot验证SMC3敲低的效果,用CCK-8实验、Transwell实验检测SMC3敲低对A549细胞的增殖和迁移能力的影响,用细胞成球等实验检测SMC3敲低对A549细胞干性的影响。结果显示,该研究成功地构建了p SUPERSMC3干扰质粒,将其转染A549细胞后SMC3蛋白质水平明显降低。实验组(p SUPER-SMC3)与正常对照组(control)及阴性对照组(p SUPER)相比,细胞增殖和迁移能力明显下降(P<0.01),细胞成球数减少,干性减弱。该实验结果表明,下调SMC3蛋白质水平可以抑制A549细胞的增殖和迁移能力,减弱细胞干性,提示SMC3对肺癌的发生和发展可能具有促进作用。该实验为寻找潜在的抗肺癌方法提供了新的实验依据。
