于芳
- 作品数：57 被引量：104H指数：6
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程理学更多>>
- 二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达被引量：2
- 2008年
- 目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
- 佟敬山李昌金宁一于源华刘玉生于芳胡宁宁李霄张钰
- 关键词：人免疫缺陷病毒GP41单链抗体原核表达稳定性
- 脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA的构建及干扰效果检测
- 2010年
- 目的:构建脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对293T细胞内源性FHIT基因表达的干扰效果。方法:根据FHIT基因序列,通过生物信息学网站预测可能的siRNA,从中筛选出2条合理的FHIT-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer2.1-U6Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建成功的FHIT-siRNA重组载体转染人胚肾细胞293T,Western印迹检测siRNA对293T内源性FHIT表达的干扰效果。结果:构建了2个FHIT-siRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的作用效果可达50%以上。结论:构建的FHIT-siRNA为进一步研究FHIT的功能提供了有利的工具。
- 林宇翔于芳绳纪坡高宁马祖兴胡宝成
- 关键词：脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA
- 抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析被引量：4
- 2007年
- 目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点,构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。BglⅡ线性化后,电转化入受体酵母菌GS115中,筛选阳性重组子,进行甲醇诱导表达,并用RT-PCR、SDS-PAGE、双抗体夹心Dot-ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果:通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌,RT-PCR、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达,表达量可占培养液上清总蛋白量的18%,双抗体夹心Dot-ELISA法检测,表达产物能够特异识别重组HIV-1gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应,证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论:成功地实现了scFv基因的分泌性表达,为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。
- 李昌金宁一王宏伟刘玉生于芳佟敬山胡宁宁
- 关键词：外膜蛋白单链抗体
- 新型抗HIV-1重组导向制剂SL41在毕赤酵母中的表达及活性实验被引量：8
- 2007年
- 以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础,通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxinA,SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41,线性化后,采用电转化法整合入巴斯德菌毕赤酵母GS115中,经His+MutS表型鉴定、PCR分析以及G418筛选获得高拷贝重组转化子.摇瓶培养、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,目的蛋白得到良好表达,表达量最高可达到47.9 mg/L.目的蛋白经初步纯化后,用于制备的HIV-1感染靶细胞复制模型进行抗体亲和力测定、细胞结合活性测定和细胞杀伤活性研究,结果显示,目的蛋白能够很好地与靶细胞模型中的HIV-1外膜蛋白gp160发生结合反应,并可介导特异的CTL反应,对靶细胞具有明显的杀伤活性,表明获得了具有生物活性的抗HIV-1重组导向制剂.
- 李昌王宏金宁一金洪涛刘玉生于芳李子健张立树
- 关键词：单链抗体分泌表达毕赤酵母
- 新型芋螺镇痛多肽SO3抗体产生的动态性观察
- 2001年
- 于芳刘凤云周艳荣戴秋云黄培堂
- 关键词：SO3抗体形成动态性
- 织锦芋螺ο家族芋螺毒素的序列分析被引量：11
- 1999年
- 为了从织锦芋螺（Ｃｏｎｕｓｔｅｘｔｉｌｅ）中尽可能多地分离出ο家族的毒素序列和研究其应用价值，在克隆了织锦芋螺α芋螺毒素的基础上进行了织锦芋螺ο家族芋螺毒素基因的分离工作．从织锦芋螺毒管中提取ｍ ＲＮＡ，通过ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍ ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｃＤＮＡ ｅｎｄｓ，ｃＤＮＡ 末端的快速扩增）－ＰＣＲ方法扩增获得ο家族芋螺毒素ｃＤＮＡ 片段，并进行克隆和序列分析．从织锦芋螺毒液中获得了６种新的芋螺毒素序列，且毒素序列的成熟肽部分均符合Ｃ－ Ｃ－ ＣＣ－ Ｃ－ Ｃ的保守半胱氨酸框架．这些是新的ο家族芋螺毒素序列，新序列的阐明为进一步研究其生物活性和应用打下了基础．
- 于芳卢柏松赵东黄培堂
- 关键词：芋螺毒素基因分离
- 白细胞介素6单克隆抗体的研制被引量：1
- 1999年
- 采用纯化的工程菌表达产物白细胞介素６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６，ＩＬ－６）免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）在ＰＥＧ作用下进行融合，通过ＥＬＩＳＡ筛选并多次亚克隆，获得了１株能分泌抗ＩＬ－６单克隆抗体的杂交瘤细胞Ｉｃ－１．３．４．５。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示：抗体结合抗原的分子量与ＩＬ－６相符，为特异性抗ＩＬ－６抗体。亚类鉴定表明：该细胞分泌的单克隆抗体为ＩｇＧ１亚类，ｋａｐｐａ型。染色体数目为１００条左右。腹水效价为１１０４，无血清培养液效价为１１０２。此杂交瘤细胞株体外传代培养６个月以上，ＥＬＩＳＡ检测抗体滴度无明显降低。
- 陈琳徐秀英边疆于芳黄培堂
- 关键词：单克隆抗体白细胞介素6
- 人MEPE/OF45基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2008年
- 目的:克隆人MEPE/OF45全长基因,为进一步研究MEPE/OF45在DNA损伤应答中的作用及特异的信号通路奠定基础。方法:选取人宫颈癌细胞HeLa为靶细胞,从中提取总RNA,设计扩增人MEPE/OF45基因片段的特异引物,进行RT-PCR分析;用蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮(CHX)对细胞进行处理,观察处理前后MEPE/OF45基因的表达情况。结果:在经CHX处理的HeLa细胞中扩增到了MEPE/OF45基因片段,随后利用重叠PCR方法获得了人MEPE/OF45全长基因,并经序列分析确证。结论:获得了人MEPE/OF45基因片段及全长基因,为阐明MEPE/OF45在细胞中复杂的功能提供了线索。
- 张鸿声高宁绳纪坡于芳张宏达张勇胡宝成
- 关键词：克隆HELA细胞
- 抗HIV-1单链抗体重组白喉毒素的构建与表达研究
- 重组免疫毒素被称为“生物导弹”，是目前肿瘤、自身免疫性疾病以及移植排斥等免疫治疗领域的热点研究方向之一。对于AIDS而言，由于免疫毒素能够特异性的杀伤HIV潜伏感染细胞，彻底摧毁病毒储存池，而对正常细胞毒性很低，从而成为...
- 于芳
- 关键词：免疫缺陷病毒单链抗体重组毒素
- 文献传递
- 抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达被引量：4
- 2007年
- 目的构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定。结果酶切及DNA序列测定鉴定正确。SDS-PAGE和West-ern Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75200的蛋白,与DT-hs120融合基因分子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体。结论成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达。
- 于芳金宁一李昌刘玉生佟敬山胡宁宁金洪涛
- 关键词：HIV-1单链抗体
