刘玉生
- 作品数：16 被引量：34H指数：4
- 供职机构：军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室更多>>
- 发文基金：吉林省应用基础研究项目国家高技术研究发展计划吉林省科技厅资助项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生理学农业科学更多>>
- 新型抗病毒蛋白CVN的构建及原核表达被引量：3
- 2007年
- 目的构建重组抗病毒蛋白CVN原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用全基因合成的方法合成目的基因CVN(Cyanovirin-N),将该片断插入到pBluescriptⅡSK(+)载体中后,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET-CVN表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。用SDS-PAGE,Western-blot等方法分析鉴定表达产物。结果合成的目的基因全长303bp,重组载体pET-CVN经PCR和双酶切鉴定,证实构建成功。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物相对分子量为17 000左右,与理论预期值完全相符。凝胶成像分析表明最高表达量可占菌体总蛋白的46.4%。SDS-PAGE,West-ern-blot分析表明目的蛋白得到了很好的表达。结论成功构建了pET-CVN原核表达载体,并得到了大量的表达,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。
- 刘玉生李昌金宁一于芳金洪涛
- 关键词：抗病毒蛋白原核表达CYANOVIRIN-N
- 单链抗体标联SEA的抗HIV基因工程靶向药物构建与活性研究
- 如何根除 HIV 感染者或 AIDS 患者体内的病毒细胞储存池,是当前限制 AIDS 治疗的最大瓶颈问题。本研究立足于靶向杀伤 HIV 感染细胞的目的,通过合成可作为导向的抗 HIV-1gp120(gp41)单链抗体基因...
- 李昌金宁一金洪涛王宏刘玉生于芳佟敬山胡宁宁
- 文献传递
- 二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达被引量：2
- 2008年
- 目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
- 佟敬山李昌金宁一于源华刘玉生于芳胡宁宁李霄张钰
- 关键词：人免疫缺陷病毒GP41单链抗体原核表达稳定性
- 抗HIV-1白喉免疫毒素的构建及原核表达
- 2007年
- 目的:构建重组DTA-hS120融合基因表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。方法:通过PCR扩增,获得只含白喉毒素(DT)活性部位(DTA)的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析鉴定。结果:酶切及DNA序列测定鉴定质粒构建正确;SDS-PAGE和Western印迹分析证实,可表达出相对分子质量为54000的融合蛋白,与DTA-hS120融合蛋白的分子量一致;经凝胶成像分析,其表达量约占菌体总蛋白的23%,表达形式主要为包涵体。结论:构建了DTA-hS120重组表达质粒,并获得了高效表达,为进一步研究抗HIV-1治疗药物奠定了基础。
- 于芳金宁一李昌刘玉生佟敬山金洪涛
- 关键词：白喉毒素基因克隆免疫毒素原核表达
- 新型抗HIV蛋白CVN的制备及生物活性研究
- 以已有的大肠杆菌及酵母生物特性和分子背景为依据,在不改变开放阅读框架(ORF)的情况下,对所获得的CVN序列列进行密码子优化和定点突变,采用全基因合成的方法,人工合成CVN的全序列。为了增强对病毒的中和活性,本实验借助I...
- 刘玉生
- 关键词：抗病毒蛋白原核表达蛋白复性生物活性
- 文献传递
- 抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达被引量：4
- 2007年
- 目的构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定。结果酶切及DNA序列测定鉴定正确。SDS-PAGE和West-ern Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75200的蛋白,与DT-hs120融合基因分子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体。结论成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达。
- 于芳金宁一李昌刘玉生佟敬山胡宁宁金洪涛
- 关键词：HIV-1单链抗体
- 抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析被引量：4
- 2007年
- 目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点,构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。BglⅡ线性化后,电转化入受体酵母菌GS115中,筛选阳性重组子,进行甲醇诱导表达,并用RT-PCR、SDS-PAGE、双抗体夹心Dot-ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果:通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌,RT-PCR、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达,表达量可占培养液上清总蛋白量的18%,双抗体夹心Dot-ELISA法检测,表达产物能够特异识别重组HIV-1gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应,证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论:成功地实现了scFv基因的分泌性表达,为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。
- 李昌金宁一王宏伟刘玉生于芳佟敬山胡宁宁
- 关键词：外膜蛋白单链抗体
- 新型抗HIV-1重组导向制剂SL41在毕赤酵母中的表达及活性实验被引量：8
- 2007年
- 以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础,通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxinA,SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41,线性化后,采用电转化法整合入巴斯德菌毕赤酵母GS115中,经His+MutS表型鉴定、PCR分析以及G418筛选获得高拷贝重组转化子.摇瓶培养、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,目的蛋白得到良好表达,表达量最高可达到47.9 mg/L.目的蛋白经初步纯化后,用于制备的HIV-1感染靶细胞复制模型进行抗体亲和力测定、细胞结合活性测定和细胞杀伤活性研究,结果显示,目的蛋白能够很好地与靶细胞模型中的HIV-1外膜蛋白gp160发生结合反应,并可介导特异的CTL反应,对靶细胞具有明显的杀伤活性,表明获得了具有生物活性的抗HIV-1重组导向制剂.
- 李昌王宏金宁一金洪涛刘玉生于芳李子健张立树
- 关键词：HIV-1单链抗体分泌表达毕赤酵母
- 抗AIDS新型导向毒素CVN-LP1融合基因的构建及原核表达被引量：1
- 2007年
- 目的:构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法:将已经构建好的pET-CVN和pET-LP1重组质粒,EcoRI和HindⅢ同时进行双酶切,保留LP1片段前端的linker序列。将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1融合表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blot鉴定表达产物。结果:重组载体pET-28a(+)-CVN-LP1经PCR及XhoI/EcoRI和EcoRI/HindIII双酶切鉴定,证实构建成功。将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物相对分子量约为20kDa,与理论大小一致。凝胶成像分析表明最高表达量可占菌体总蛋白的49.58%。SDS-PAGE、Western-blot分析表明目的蛋白得到了很好的表达。结论:构建了pET-CVN-LP1原核表达载体,并得到了目的融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。
- 李昌金宁一刘玉生于芳金洪涛李臻佟敬山胡宁宁
- 关键词：核糖体失活蛋白
- 猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定被引量：1
- 2008年
- 通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF3全基因,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-ORF3表达载体,转入E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。Ni-NTA层析柱纯化表达蛋白,用SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA等方法分析鉴定表达产物。结果成功扩增到345bp的目的基因;构建了重组表达载体pET28a-ORF3;转化宿主菌E.coliBL21(DE3)后表达产物的相对分子质量在6.50～16.5kDa之间,与预期表达的目的蛋白相对分子质量相符;表达的目的蛋白能与阳性猪源和人源血清发生特异性反应,证实其具有较好的反应原性。
- 屈勇刚贾鹏金宁一陆民孙中锋朱光泽于芳刘玉生夏志平
- 关键词：戊型肝炎病毒结构蛋白原核表达
