王文玉
- 作品数：12 被引量：9H指数：2
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- 鹿结核分枝杆菌流行株Rv3874-Rv3875融合基因的克隆及原核表达
- 2014年
- 以吉林农业大学经济动物疾病实验室分离并保存的鹿结核分枝杆菌流行株为模板,利用重叠延伸剪接技术(Splicing by overlap extension,SOE)设计引物,克隆Rv3874-Rv3875融合基因,构建重组表达质粒p GEX-4T-1-Rv3874-75,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,并对目的蛋白进行纯化,表达产物通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明:测序后融合基因Rv3874-Rv3875的序列与Gen Bank中序列的符合率为100%,重组表达质粒p GEX-4T-1-Rv3874-75在大肠杆菌中成功诱导表达,获得可溶性表达的融合蛋白,经SDS-PAGE分析该蛋白的相对分子质量约49 ku,经Western blot鉴定纯化好的融合蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应,具有良好的反应原性。
- 曾范利王文玉宋纪伟时坤李健明刘东旭刘杨杜锐
- 关键词：流行株融合基因克隆原核表达
- 鹿结核病流行株与卡介苗差异基因原核表达质粒的构建及表达
- 2014年
- 以吉林农业大学经济动物疾病实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株的基因组为模板,应用PCR方法从已构建的鹿结核病野毒株与卡介苗差异基因文库中扩增RD1区的Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875和Rv3878 5段目的基因,分别与p MD18-T Simple Vector连接,经PCR、酶切鉴定后的阳性重组克隆质粒与原核表达载体p GEX-4T-1连接并进行原核表达,采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物的反应原性进行初步研究。基因测序结果显示差异基因与期望的序列一致,并在大肠杆菌中成功诱导表达,获得以可溶形式表达的目的蛋白,经SDS-PAGE分析目的蛋白的相对分子量与理论值相符,经Western blot鉴定纯化好的目的蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应,具有良好的反应原性,为其在鹿结核病血清诊断学中的应用奠定了试验基础。
- 王文玉曾范利时坤李健明刘红娜杜锐
- 关键词：差异基因原核表达反应原性
- 牛病毒性腹泻—黏膜病病毒C_(24)V株E_0截短基因密码子优化及其在卡介苗中的表达被引量：2
- 2014年
- E0基因编码的蛋白是牛病毒性腹泻—黏膜病病毒(BVDV)的主要保护性抗原之一,其是研制BVDV基因工程疫苗的候选者。E0基因在卡介苗中难以表达,已有研究结果表明E0蛋白具有RNase活性。根据卡介苗密码子使用频率分析E0基因,发现其有多个稀有密码子。通过对该基因截短和密码子优化,在卡介苗中表达E0基因,检测到了E0蛋白的抗原活性,为构建可同时预防结核和牛病毒性腹泻—黏膜病的二价基因工程疫苗奠定基础。
- 张云郝俊伟刘红娜王文玉杨宇航时坤李健明杜锐
- 关键词：牛病毒性腹泻E0基因密码子重组卡介苗
- 应用流式细胞术检测BVDV-E_2截短基因重组卡介苗对小鼠的免疫效果被引量：1
- 2014年
- 为评价牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对小鼠的免疫效果,用BVDV-E2截短基因重组卡介苗pMV361-E11、pMV361-E12、pMV361-E13、pMV361-E21、pMV361-E22、pMV361-E23及卡介苗、BVDV灭活苗和生理盐水对试验小鼠进行腹腔免疫,在三免后14d取其脾脏对T、B淋巴细胞、树突状细胞及Th1细胞等细胞因子进行流式细胞术检测,评价各重组卡介苗的免疫效果。结果显示,pMV361-E23重组卡介苗组中各细胞因子的表达量尽管有个别因子在同组中不是最高,但均高于同组生理盐水的表达量(除INF-γ检测中略低外);pMV361-E12组中IL-12的含量高达9.7。表明pMV361-E23和pMV361-E122组截短重组卡介苗免疫效果较好,为预防牛病毒性腹泻病以及新型疫苗的研制奠定基础。
- 杨宇航宋纪伟时坤曾范利李健明刘红娜王文玉郝俊伟刘东旭杜锐
- 关键词：重组卡介苗流式细胞术免疫效果
- 鹿结核病流行株与卡介苗差异基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立
- 鹿结核病是在全球范围内广泛传播的一种慢性、消耗性人畜共患传染病，它主要是由牛分枝杆菌和结核分枝杆菌引起的一种细菌性疾病，严重威胁着养鹿业的健康发展。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是可用...
- 王文玉
- 关键词：鹿结核病原核表达间接ELISA
- 文献传递
- 鹿布鲁菌分型实时荧光定量PCR检测方法的建立
- 2014年
- 鹿布鲁菌病主要是由牛型、羊型和猪型布鲁菌引起的,其他感染型少见,本研究依据布鲁菌的特异性基因BruAB20168、BMEII0466、BR0952上的部分高度保守片段设计猪型、牛型、羊型引物和探针,用于检测并区分鹿源布鲁菌的种型,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到pUC57载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布氏菌各分型荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线敏感性可知该方法的最低检测浓度分别可达到12、9、8copies/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。
- 郝俊伟时坤曾范利李健明王文玉杨宇航刘红娜张云张秀丽杜锐
- 关键词：布鲁菌实时荧光定量PCR
- 牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E_2基因重组卡介苗的构建
- 2014年
- 本试验将成功克隆的牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因与大肠杆菌-分枝杆菌整合表达载体pMV361连接,构建重组整合质粒pMV361-E2。并确定了电转化的最佳条件:2.0 kV/cm、25μF、1 000Ω,成功获得了E2基因重组卡介苗。在45℃下热诱导E2基因在重组卡介苗中的表达,通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测,结果显示,在44 kD处出现目的条带,符合E2基因表达蛋白的大小,表明牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因在卡介苗中成功表达。
- 时坤王文玉王慧慧曾范利李健明杜锐
- 关键词：E2基因
- 水貂阿留申病毒NS1基因在大肠杆菌中的分段表达
- 2014年
- 利用DNAStar Protean模块预测分析水貂阿留申病毒(aleutian disease virus,ADV)NS1基因后,设计3对特异性引物,以吉林农业大学经济动物实验室保存的NS1全长克隆质粒NS1-pMD18-T为模板扩增NS1基因的3个截短片段,分别命名为L1 N1、L2 N2、L3 N3基因,构建克隆质粒pMD18-T-L1N1、pGEM-T-L2N2及pMD18-T-L3N3。经测序鉴定正确后,将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的3个NS1基因片段连接至经相同双酶切的pGEX-4T-1原核表达载体,并转化入表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blotting检测重组菌在大肠杆菌中的表达情况。结果表明,成功构建了3段重组原核表达质粒pGEX-4T-L1N1、pGEX-4T-L2N2、pGEX-4T-L3N3,SDS-PAGE结果显示分别表达出大小约57、51、44ku的目的条带,与预期相符。Western blotting进一步证实获得的3种蛋白能被ADV阳性血清识别,具有反应原性。本试验首次对ADV NS1基因在大肠杆菌中进行分段表达,为后续研制ADV的亚单位疫苗奠定基础。
- 刘红娜王文玉张云杨宇航郝俊伟时坤李健明杜锐
- 关键词：大肠杆菌
- 鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法
- 鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法。该检测法选用的生物材料有：纯化蛋白GST-Rv3872-74-75，牛血清白蛋白BSA，兔抗鹿IgG-HRP，标准阳性血清，标准阴性血清，待检血清。检测步骤包括包被抗原...
- 杜锐王文玉曾范利时坤宗颖李健明刘东旭
- 文献传递
- 鹿结核病流行株融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875的原核表达
- 2014年
- 以本实验室保存的鹿体内分离并鉴定的结核病流行株为模板,利用重叠延伸剪接技术设计融合基因的引物,扩增融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3872-Rv3874-Rv3875;重组表达质粒被转化入大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,并采用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法对目的蛋白进行纯化。基因测序结果显示,融合基因Rv3872-Rv3874-Rv3875的序列与GenBank中序列的符合率为99.89%。SDS-PAGE分析显示,融合基因在大肠杆菌中成功被诱导表达,获得以可溶形式表达的融合蛋白,该蛋白的分子质量约为60ku。Western-blot鉴定结果显示,纯化好的融合蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应,说明该融合蛋白具有良好的反应原性,这一结果为它在鹿结核病血清学诊断中的应用奠定了试验基础。
- 王文玉宋纪伟曾范利时坤李健明张云刘东旭俊伟杜锐
- 关键词：鹿结核病融合基因原核表达反应原性
