据对虾白斑综合症病毒(WSSV)的基因保守序列,使用Primer Explorer V3软件设计了2条引物,利用PCR的扩增产物,结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立了一种对虾白斑综合症病毒的DHPLC快速检测方法。该检测方法特异性好,与传染性皮下和造血器官坏死病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾杆状病毒以及对虾基因组DNA无交叉反应;检测灵敏度较高,约为10-5ng/μL,高于常规PCR及荧光定量PCR的灵敏度。用建立的DHPLC方法对100尾对虾样品进行了临床检测,结果与荧光定量PCR检测结果一致。WSSV的DHPLC检测方法,特异性强、灵敏度高,是对WSSV进行有效检测的一种新方法。
实时荧光定量PCR(q PCR)是检测食源性病毒的常用方法,其高度的灵敏性导致检测过程中容易产生假阳性结果。基因序列比对法是比利时根特大学食品微生物与食品保藏实验室新近建立的验证q PCR阳性结果真伪的一种方法。本研究以检测贝类诺如病毒GII.4(No V GII.4)为例,采用基因序列比对法验证q PCR阳性结果的真伪。在q PCR检测时添加102copies/m L的No V GII.4质粒作为标准阳性对照,旨在排除由于q PCR的高灵敏性而产生的假阳性结果。研究结果表明,在8份No V阳性的贝类样品中,2份为No V GII.4真阳性,2份可能为No V GII.4的变异株,1份为受到质粒污染的假阳性,其余3份为引物二聚体所致假阳性。基因序列比对法作为一种验证q PCR阳性结果真伪的高效、可行的方法,值得推广。
建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有3尾感染HRV,与病毒分离结果一致,说明LAMP方法比较适合牙鲆弹状病毒的早期及现场诊断。
