刘庆成
- 作品数：16 被引量：36H指数：4
- 供职机构：深圳市疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金深圳市科技计划项目国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学环境科学与工程更多>>
- 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1在苯并（a）芘诱导人支气管上皮细胞DNA甲基化改变中的作用被引量：7
- 2011年
- 目的 观察苯并（a）芘[benzo（a）pyrene,B（a）P]诱导体外细胞DNA甲基化水平改变,探讨聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly（ADP-ribose）polymerase 1,PARP1]在该过程中的作用.方法 以1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0 μmol/L浓度B（a）P分别处理人支气管上皮细胞（16HBE）及其PARP1缺陷细胞（16HBE-shPARP1）72 h.采用免疫荧光和高效毛细管电泳检测其基因组DNA整体甲基化水平改变,同时动态监测PARP1和DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferases 1,DNMT1）表达的变化.结果 16HBE和16HBE-shPARP1细胞基因组整体甲基化百分比（mCpG%）分别为（4.04±0.08）%和（9.69±0.50）%.经5-氮杂脱氧胞苷（DAC）处理72 h后,mCpG%值分别下降为（3.15±0.14）%、（6.07±0.54）%.经B（a）P染毒72 h后,16HBE细胞基因组mCpG%值[B（a）P浓度由低到高]分别为（5.10±0.13）、（4.25±0.10）、（3.91±0.10）、（4.23±0.27）、（3.70±0.15）、（3.08±0.07）;16HBE-shPARP1细胞基因组mCpG%值（浓度由低到高）分别为（10.63±0.60）、（13.08±0.68）、（9.75±0.55）、（7.32±0.67）、（6.90±0.49）、（6.27±0.21）.两种细胞不同处理组间mCpG%差异有统计学意义（F值分别为61.67、60.91,P值均＜0.01）.16HBE细胞各剂量组[B（a）P浓度由低到高]PARP1基因mRNA相对表达水平分别为对照组的141.0%、158.0%、167.0%、239.0%、149.0%、82.9%,差异均有统计学意义（t值分别为11.45、17.32、32.24、33.44、20.21、9.87,P值均＜0.01）;16HBE-shPARP1细胞各剂量组（浓度由低到高）PARP1基因mRNA相对表达水平分别为对照组的169.0%、217.0%、259.0%、323.0%、321.0%、256.0%,差异有统计学意义（t值分别为9.06、15.92、22.68、26.23、37.19、21.15,P值均＜0.01）.当B（a）P染毒剂量达5.0 μmol/L后,16HBE细胞各剂量组（浓度由低到高）DNMT1基因mRNA相对表达水平分别为对照组的125.0%、162.0%、275.0%、233.0%,差异有统计学意义（t值分别为12.74、24.92、55.1
- 陶功华龚春梅杨淋清刘庆成刘建东吴德生胡辛楠黄海燕刘建军柯跃斌庄志雄
- 关键词：DNA甲基化
- 人支气管上皮细胞聚-ADP-核糖水解酶缺陷细胞株的构建及鉴定被引量：5
- 2012年
- 目的建立高效、稳定的人支气管上皮细胞(16HBE)的聚-ADP-核糖水解酶(PARG)缺陷细胞株,为研究PARG在环境毒物诱导细胞损伤中的作用及了解聚-ADP-核糖基化反应的功能奠定基础。方法设计并合成能编码特异靶向人PARG基因的短发夹RNA(shRNA)的oligo DNA,将之插入到真核表达载体plko.1-puro中构建重组质粒,鉴定成功后转染至正常的16HBE细胞中,RT-PCR及western blot检测完成筛选细胞株的PARG基因及蛋白水平的表达,并使用流式细胞仪分析构建成功细胞株的生长周期变化。结果重组质粒测序鉴定正确;RT-PCR及western blot检测显示最终选定的缺陷细胞株干扰效率达80%以上,效果显著(与正常细胞相比,P<0.05);且缺陷细胞株的生长周期未见明显变化(P>0.05)。结论该研究成功构建了高效、稳定的人支气管上皮细胞的PARG缺陷细胞株,为阐明ADP-核糖基化反应的作用机制及其生物学效应提供了可靠的平台。
- 蔡剑锋黄海燕刘建军杨淋清吴德生夏菠毛吉炎胡恭华刘庆成李习艺庄志雄
- 关键词：慢病毒载体
- 短期暴露于纳米SiO2对HaCaT细胞基因组DNA甲基化的影响被引量：2
- 2013年
- 目的探讨纳米SiO2对体外培养细胞基因组总体DNA甲基化水平的影响。方法分别以2.5、5、10μg/ml纳米SiO2溶液和10μg/ml微米级SiO2处理人皮肤表皮细胞系(HaCaT)24h;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理48 h的10μg/ml组为阳性对照,并设立溶剂对照组。应用高效毛细管电泳(HPCE)定量分析纳米SiO2处理细胞24h后,基因组DNA总体甲基化的变化,用Q-PCR和Western Blot方法检测甲基化相关蛋白mRNA和蛋白的表达变化,并用DNA甲基化转移酶活性试剂盒检测DNA甲基化转移酶的活性。结果 HPCE定量分析结果显示纳米SiO2可引起HaCaT细胞总体甲基化程度降低,呈剂量依赖性关系;与正常细胞相比,微米SiO2以及2.5、5和10μg/ml纳米SiO2组分别降低37.8%、43.9%、54.9%和52.8%,差异有显著性(P<0.05);对照组5-aza-dC处理后使HaCaT细胞甲基化程度减少27.3%。各组酶的蛋白表达与mRNA表达水平及DNMTs活性变化具有相同的变化趋势,经纳米SiO2处理的HaCaT细胞,DNMT1、DNMT3a及MBD2表达随着纳米SiO2剂量的上升而下降,DAC组表达水平最低。结论纳米SiO2能引起HaCaT细胞整体基因组DNA甲基化水平降低,可能与DNA甲基化转移酶的酶活性降低有关。
- 龚春梅杨淋清陶功华刘庆成刘建军庄志雄
- 关键词：DNA甲基化纳米SIO2
- 长期低剂量甲醛暴露对16HBE细胞整体甲基化的影响
- 目的:为探讨甲醛致癌的表观遗传学机制,揭示长期低剂量甲醛暴露与细胞基因组整体低甲基化之间的关系,本研究观察长时间低剂量甲醛暴露对16HBE细胞基因组整体甲基化水平的影响。
- 刘庆成杨淋清龚春梅陶功华黄海燕刘建军张慧敏吴德生夏菠胡恭华王昆鹏庄志雄
- 文献传递
- CYP2E1基因RNA干扰载体的构建与表达被引量：4
- 2012年
- 目的:构建CYP2E1基因shRNA慢病毒表达载体,为研究CYP2E1在药物代谢和环境污染物代谢中的作用提供技术支持。方法:通过NCBI检索CYP2E1序列,设计合成3对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体PLKO.1-puro,将重组质粒转化到感受态JM107中。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒和包膜蛋白质粒共转染到293FT细胞,收集病毒上清,转导肝细胞L02,利用嘌呤霉素筛选得到CYP2E1缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果结果:PCR和测序结果证明双链shRNA已经正确插入慢病毒载体PLKO.1-puro,共转染293FT细胞得到高滴度病毒,转导L02细胞筛选出CYP2E1基因沉默细胞,荧光定量PCR检测shRNA3的最高抑制效率为86.9%,Western blot鉴定shRNA3基本无CYP2F1表达。结论:利用慢病毒介导RNAi技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞。
- 毛吉炎徐新云何晓阳毛侃琅黄海燕刘庆成
- 关键词：CYP2E1RNA干扰慢病毒
- 双酚A对小鼠胚胎干细胞OCT4及SOX2基因表达的影响被引量：2
- 2013年
- 目的探讨双酚A（bisphenolA，BPA）对小鼠胚胎干细胞（mESC）的毒性特征及OCT4、SOX2基因表达的影响。方法分别以10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／L浓度的BPA及二甲亚砜（溶剂对照组，DMSO）处理mESC系（S6）细胞24h，重复处理3次，倒置显微镜下观察正常组、染毒组细胞的形态变化，CCK-8法检测BPA对细胞增殖的影响，计算半数抑制浓度（IC50）；分别采用real—time（RT）一Q—PCR和western—blotting技术检测BPA作用下OCTg、SOX2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。结果BPA对mESC有一定的毒性作用，染毒浓度越大，细胞活性越小，二者呈剂量-效应关系，并通过计算得出BPA对mESC的IC50为4．3×10^-4mol／L，同时结合BPA的环境相关暴露浓度和相关资料，最终取10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／L系列浓度作为后续实验浓度；BPA处理24h后，mESC细胞形态发生改变，较高浓度组与对照组比较，细胞数量明显减少，出现少许漂浮的细胞，克隆变得不规则，分化趋势明显。BPA浓度为10^-7、10^-6、10^-5、10^-4的OCT4mRNA相对表达量分别为1．146±0．087、1．156±0．030、1．158±0．103、1．374±0．053，均高于对照组（1．000±0．000）（t值分别为-2．384、-2．953、-3．203、-4．021，P值均〈0．05）；BPA染毒浓度为10^-4mol／L（1．113±0．052）的SOX2mRNA相对表达水平高于对照组（1．000±0．000）（t=-2．765，P〈0．05）。染毒浓度为10^-5、10^-4mol／L的OCT4蛋白质相对表达量分别为1．360±0．168、1．602±0．151，均高于DMSO组（1．0004-0．000），差异有统计学意义（t值分别为-3．538、-4．002，P值均〈0．05）；而各浓度组SOX2蛋白相对表达水平差异无统计学意义。结论BPA对mESC具有一定的细胞毒性，在一定剂量范围内BPA可以使mESCOCT4基因表达增加，而对SOX2基因无明显影响。
- 罗凌凤杨淋清吴德生周明龚春梅刘庆成夏菠黄冠琴匡侠锋庄志雄张文昌
- 关键词：胚胎干细胞双酚A
- 人支气管上皮细胞聚-ADP-核糖水解酶缺陷细胞株的构建及鉴定
- 目的：建立高效、稳定的人支气管上皮细胞(16HBE)的聚-ADP-核糖水解酶(PARG)缺陷细胞株,为研究PARG在环境毒物诱导细胞损伤中的作用及了解聚-ADP-核糖基化反应的功能奠定基础.方法：设计并合成能编码特异靶向...
- 黄海燕蔡剑锋刘建军杨淋清吴德生夏菠刘庆成庄志雄
- 关键词：支气管上皮细胞慢病毒载体
- 三氯乙烯致雄性大鼠精子损伤的研究
- 2013年
- 目的研究三氯乙烯体外染毒对SD大鼠精子的损伤。方法0、2、4、6、8、10mmol／L的三氯乙烯对SD大鼠附睾精子体外染毒后4h收获细胞，吉姆萨染色法观察精子的形态变化，流式细胞仪检测精子线粒体膜电位的改变。结果6、8、10mmoYL三氯乙烯剂量组精子运动能力明显降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。8、10mmol／L三氯乙烯剂量组精子形态总畸变率明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈O．01）。随染毒剂量的增高，精子细胞线粒体膜电位下降的比例升高，4、6、8、10mm01]L三氯乙烯染毒剂量组精子细胞凋亡率与对照组的差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论三氯乙烯体外染毒可导致雄性SD大鼠精子细胞运动能力下降，精子畸形率升高，凋亡率增加。
- 吴德生杨淋清黄遂刘建军徐新云黄海燕龚春梅胡恭华刘庆成杨细飞洪文旭周丽黄新凤袁建辉庄志雄
- 关键词：三氯乙烯精子线粒体膜电位
- 纳米二氧化硅对体外培养HaCaT细胞凋亡的影响被引量：4
- 2013年
- [目的]比较不同粒径(15、30、100 nm)纳米二氧化硅(nano-SiO2)和常规二氧化硅(Micro-SiO2)对人皮肤表皮细胞(HaCaT)生长的抑制作用及凋亡的影响。[方法]采用不同浓度(2.5、5、10μg/ml)不同粒径(15、30、100 nm)的nano-SiO2和10μg/ml的Micro-SiO2(1～5μm)染毒体外培养的HaCaT细胞24 h,同时设溶剂对照组(nano-SiO2和Micro-SiO2的分散液染毒组)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测HaCaT细胞暴露于不同浓度、不同粒径的nano-SiO2后的细胞活力,用Annexinⅴ-PI双染法和Hoechest33342染色法测定细胞凋亡情况;使用2’,7’-二乙酰二氯荧光素荧光探针检测细胞内活性活性氧(ROS)水平。[结果]不同粒径的nano-SiO2纳米对HaCaT细胞的半数抑制浓度分别为(19.4±1.3)、(27.7±1.5)、(35.9±1.6)μg/ml。当染毒浓度固定时,随着nano-SiO2粒径的减小,凋亡率逐渐增加。当粒径固定时,胞内ROS的水平也随着nano-SiO2浓度的增大而增高。相关分析表明,细胞存活率和凋亡率与胞内活性氧的水平的相关性分别为-0.952和0.898(P<0.01)。[结论]nano-SiO2能抑制HaCaT细胞生长并可诱导其凋亡,这种现象的发生可能与胞内产生的活性氧水平有关。
- 龚春梅杨淋清陶功华何浩伟刘庆成吴德生刘建军庄志雄
- 关键词：纳米二氧化硅细胞增殖细胞凋亡活性氧
- 纳米SiO_2对HaCaT细胞基因组DNA总体甲基化水平的影响被引量：1
- 2012年
- 目的检测纳米SiO2(nano-SiO2)暴露的体外培养的人皮肤表皮细胞(HaCaT)基因组DNA总体甲基化水平及DNA甲基转移酶DNMT1的表达改变。方法应用5-甲基胞嘧啶免疫荧光法和流式细胞定量分析法检测nano-SiO2(0、2.5、5和10μg/ml)和10μg/ml微米级二氧化硅(micro-SiO2)以及DAC组(10μg/ml nano-SiO2+3μm DAC)暴露后细胞基因组DNA整体甲基化变化趋势,以Real-time Q-PCR和Western blot方法检测DNMT1的mRNA和蛋白的表达变化。结果与对照细胞组相比,5-甲基胞嘧啶免疫荧光强度逐渐降低,在nano-SiO2致HaCaT细胞损伤的过程中,DNA的总体甲基化程度有随nano-SiO2浓度升高而降低的趋势,同剂量的纳米暴露组与溶剂对照组及微米级对照组相比具有更低的基因组DNA甲基化水平。流式细胞定量分析实验结果显示,溶剂对照组的平均荧光荧光强度为153.43,不同浓度的nano-SiO2处理细胞24 h(2.5,5和10μg/ml)后,其平均荧光强度分别为76.32,53.26和55.16,溶剂对照组和微米对照组(Micro-SiO2)的甲基化程度差异没有统计学意义。DNMT1的mRNA和蛋白表达水平一致,在细胞暴露于nano-SiO2过程中,DNMT1表达呈下降趋势。结论本试验条件下,基因组DNA甲基化水平的降低可能与DNMT1水平降低有关。
- 龚春梅杨淋清陶功华刘庆成刘建军庄志雄
- 关键词：HACATDNA甲基化DNMT1
