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崔文禹: 作品数：10 被引量：19H指数：3; 供职机构：北京生物制品研究所有限责任公司更多>>; 发文基金：国家科技支撑计划艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项国家科技重大专项更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达、纯化及其黏膜免疫佐剂作用被引量：1: 2011年; 目的原核表达、纯化大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),并评价其黏膜免疫的佐剂作用。方法从产毒素大肠杆菌44815菌株中扩增出LTB基因,克隆至质粒pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-LTB,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达的LTB经纯化后进行神经节苷脂GM1结合活性及黏膜免疫佐剂活性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组LTB主要为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的15%;纯化的LTB纯度可达95%以上,可与兔抗CTB血清发生特异性反应,且具有GM1结合活性及良好的黏膜免疫佐剂活性。结论在大肠杆菌中成功表达了重组LTB蛋白,纯化的LTB具有良好的黏膜免疫佐剂活性。; 崔文禹李媛媛单璞凌媛李计来徐静

抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定被引量：6: 2009年; 目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。; 崔文禹徐静李树香刘敬王欣怡赵玉秀陈蕾沈心亮; 关键词：肠道病毒71型单克隆抗体

肠道病毒71型抗原含量检测方法的建立及初步验证: 目的：建立肠道病毒71型(EV71)抗原含量检测方法并进行初步验证，用于疫苗研制及生产过程中抗原含量的检测。方法：以抗EV71单克隆抗体为包被抗体，酶标抗EV71多克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA...; 徐静崔文禹李树香刘敬王欣怡陈蕾沈心亮; 关键词：肠道病毒病毒感染酶联免疫吸附; 文献传递

乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及纯化被引量：2: 2011年; 目的原核表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),纯化HBcAg病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP),并对其理化性质进行鉴定。方法根据大肠杆菌密码子偏爱性对HBcAg基因进行密码子优化,全基因合成优化基因,克隆至载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-HBcAg,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。重组蛋白经盐析和层析纯化后,经SDS-PAGE、Western blot、电镜观察、等电点分析、高效液相色谱(HPLC)分析和N-末端氨基酸测序等进行鉴定。结果重组表达质粒经酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为21 000,为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的21.6%;纯化后其纯度可达99.4%,具有良好的反应原性,VLP形成良好,结构均一,等电点在pH 6.0～6.9之间,HPLC分析形成T3和T4两种不同结构,N-末端序列正确,无氨基酸降解。结论已成功构建了HBcAg原核表达质粒,并获得了高纯度的HBcAgVLP,为进一步研究HBcAg VLP的生物学特性奠定了基础。; 李计来徐静王娟吴刚崔文禹赵莉许丽锋; 关键词：病毒样颗粒原核细胞基因表达纯化

呼吸道合胞病毒培养及其病毒滴度检测方法的建立被引量：1: 2015年; 目的确定呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）培养条件,筛选病毒保护剂配方,并建立检测病毒滴度的微量细胞病变方法。方法分别将Hep2、Vero和293R细胞以0.01 MOI接种RSV,选择病毒培养细胞基质;将RSV分别以0.005和0.02 MOI接种Hep2细胞,在4～9 d收获病毒液,检测病毒滴度,确定最佳MOI及病毒收获时间;将6种配方病毒保护剂分别加至病毒液中,反复冻融7次,检测病毒滴度,筛选最佳配方;将病毒分别在33和37℃条件下滴定,第7、9天判定结果,确定微量细胞病变方法的培养温度和判定时间。结果确定病毒培养细胞基质为Hep2细胞,以0.02 MOI RSV接种后,37℃培养7～9 d收获病毒液;配方1（0.1%人血白蛋白）为最佳病毒保护剂配方;微量细胞病变法的实验条件为37℃滴定,7 d判定结果。结论建立了稳定可靠的呼吸道合胞病毒培养及病毒滴度检测方法。; 王欣怡李树香刘敬崔文禹徐静; 关键词：呼吸道合胞病毒病毒滴度

肠道病毒71型抗原含量检测方法的建立及初步验证被引量：1: 2009年; 目的建立肠道病毒71型（EV71）抗原含量检测方法并进行初步验证，用于疫苗研制及生产过程中抗原含量的检测。方法以抗EV71单克隆抗体为包被抗体，酶标抗EV71多克隆抗体为检测抗体，建立双抗体夹心ELISA方法，以本室自制EV71抗原参考品为定量标准，建立抗原标准曲线，确定定量限度及最佳定量范围，并对该方法的准确度、精密度和特异性进行初步验证。结果建立了双抗体夹心检测EV71抗原含量的ELISA方法，定量限度为0．23μg／ml，最佳定量范围为7．32～0．23μg／ml，相关系数为R^2=0．9976；准确性较好，回收率在90％～110％之间；精密性较好，变异系数小于10％；除与EV71样品有特异性反应外，与其他样品无交叉反应。结论建立了检测EV71抗原含量的双抗体夹心ELISA方法并进行了初步验证，为疫苗研制过程中抗原含量测定提供了简便、快捷的检测手段。; 徐静崔文禹李树香刘敬王欣怡陈蕾沈心亮; 关键词：肠道病毒属酶联免疫吸附测定

抗TNF-α单链抗体的表达及其纯化被引量：2: 2009年; 克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(ScFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定。采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(VL,VH),构建ScFv基因,将ScFv基因片段与pGEX-4T-1表达载体连接,在大肠杆菌中表达并采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)进行可溶性纯化,最后鉴定其生物活性。结果显示,得到了功能性重排的轻、重链可变区基因,分别构建了VH和VL不同连接顺序的HLL(VH-Linker-VL)和LLH(VL-Linker-VH)两种ScFv,LLH的表达量较HLL的高,但亲和力不及HLL。采用Sarkosyl溶解包涵体,对目的蛋白进行可溶性纯化,蛋白纯度达到90%,纯化后的蛋白经ELISA和WB证明ScFv维持了亲本抗体与TNF-α特异性结合的能力,且具有细胞毒中和活性。实验中研究探索了一种新颖的,操作简单,省时的裂解、纯化方案,实现了单链抗体经原核系统的表达后得以可溶性纯化。; 凌媛徐静许丽锋崔文禹李媛媛李树香; 关键词：TNF-Α 单链抗体纯化

抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达被引量：3: 2014年; 目的构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定。方法分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人Ig G1重链恒定区基因连接,VL基因与人Ig G1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入p Opti VECTM-TOPO誖TA载体,轻链基因连入pc DNATM3.3-TOPO誖TA载体,构建重链表达质粒p Opti VEC-H和轻链表达质粒pc DNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经Mab Select Sure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数。结果鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长。嵌合表达载体p Opti VEC-H和pc DNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确。经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml。纯化的嵌合抗体纯度达99%以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L。结论成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力; 陈刚李计来崔文禹凌媛徐静张云涛; 关键词：血管内皮生长因子嵌合抗体 CHO细胞

二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达及生物学特性鉴定: 2009年; 目的构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体原核表达质粒,并进行表达和生物学特性鉴定。方法利用SWISS-PROT软件分析抗TNF-α单链抗体(scFv)的结构,并结合二硫键稳定的单链抗体(ds-scFv)的突变位点设计原则,确定其突变位点,采用PCR定点突变的方法,构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosy)l对表达的目的蛋白进行可溶性纯化,并进行抗原结合活性、相对稳定性及细胞毒中和活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确。抗TNF-α的ds-scFv的表达量占菌体总蛋白的16.6%,主要以包涵体形式表达;纯化的目的蛋白纯度可达94.4%;经ELISA及Western blot验证,ds-scFv与TNF-α抗原的结合活性与scFv相近;相对稳定性优于scFv;在同样的抗体浓度下,scFv和ds-scFv的细胞毒中和活性略低于亲本鼠单抗,ds-scFv略高于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达质粒,并获得有活性的目的蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。; 凌媛徐静许丽锋崔文禹李媛媛李树香; 关键词：肿瘤坏死因子-Α 原核表达生物学特性

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定被引量：4: 2014年; 目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。; 崔文禹李计来凌媛李树香刘敬王欣怡徐静张云涛; 关键词：肿瘤坏死因子-Α 单克隆抗体 CHO细胞

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