张铁娥
- 作品数：6 被引量：14H指数：2
- 供职机构：山西医科大学基础医学院医学寄生虫学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金山西省高等学校大学生创新创业训练项目山西省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 刚地弓形虫棒状体蛋白17的生物信息学分析、克隆表达及重组蛋白的免疫保护性研究
- 目的 用生物信息学方法分析刚地弓形虫棒状体蛋白17（TgROP17）的结构特性与抗原表位;克隆表达TgROP17基因，并对重组刚地弓形虫棒状体蛋白17（rTgROP17）进行纯化和抗原性分析;观察不同剂量rTgRO...
- 张铁娥
- 关键词：刚地弓形虫重组蛋白滴鼻免疫黏膜疫苗免疫保护性
- 文献传递
- 刚地弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)真核表达载体的构建、表达及其激酶活性分析被引量：5
- 2014年
- 目的构建刚地弓形虫RH株棒状体蛋白17(ROP17)真核表达载体,对表达产物进行激酶活性的检测和功能分析。方法根据刚地弓形虫ROP17蛋白编码基因(GenBank登录号为AM075203.1)设计引物,以弓形虫RH株速殖子总RNA为模板,RT-PCR扩增目的基因片段,克隆至真核表达载体p3×Flag-CMV-14,构建重组质粒p3×Flag-CMV-14/TgROP17。经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染至人胚肾细胞(HEK293T),RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分析表达产物;Western blotting检测其激酶活性;流式细胞术分析ROP17对转染宿主细胞凋亡的影响。结果 RT-PCR结果显示,从RH株弓形虫速殖子中扩增出约1 850 bp的基因片段。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒p3×Flag-CMV-14/TgROP17构建成功且序列正确。RT-PCR和Western blotting结果显示,在转染p3×Flag-CMV-14/TgROP17的细胞中有TgROP17的表达,基因片段大小为1 850bp,蛋白质相对分子质量(Mr)约为70 000,而转染空质粒组未见表达。Western blotting结果显示,ROP17可以磷酸化c-Jun蛋白;流式细胞术结果显示,ROP17抑制喜树碱(CPT)诱导的细胞凋亡,6 h和12 h的抑制率分别为20.6%和24.1%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了真核表达载体p3×Flag-CMV-14/TgROP17,其表达产物具有激酶活性且能够抑制细胞凋亡。
- 王海龙殷丽天张铁娥关丽孟晓丽刘红丽殷国荣
- 关键词：刚地弓形虫真核表达丝氨酸苏氨酸激酶细胞凋亡
- 重组刚地弓形虫棒状体蛋白17(rTgROP17)滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答
- 目的 观察不同剂量重组刚地弓形虫棒状体蛋白17(rTgROP17)滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答.方法 40只BALB/c小鼠,随机分为5组,分别用15 μg、25μg、35 μg、45 μg rTgROP17溶于20 μl...
- 张铁娥关丽王海龙孟晓丽殷国荣
- 关键词：刚地弓形虫黏膜免疫
- 刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶基因的克隆及原核表达
- 2013年
- 目的克隆刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶(TgPDI)基因,原核表达、纯化重组TgPDI蛋白,并分析其免疫反应性。方法制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgPDI基因全长编码序列(登录号为AJ306291.2)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切并测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗His抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白及其免疫反应性;重组蛋白His-TgPDI通过Ni2+琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,纯化蛋白经SDSPAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度。结果 RT-PCR扩增产物约为1 427 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得约57 kDa的可溶性重组蛋白。Western blotting结果表明,诱导表达的重组蛋白能被兔抗弓形虫血清识别。亲和纯化后获得纯度大于95%的重组TgPDI蛋白质。结论克隆得到弓形虫PDI基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白,且该重组蛋白具有免疫反应性。
- 王海龙李润花殷丽天孟晓丽刘红丽张铁娥关丽殷国荣
- 关键词：刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶原核表达免疫反应性
- 刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因的克隆和原核表达及纯化和抗原性分析被引量：1
- 2013年
- 目的克隆刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1(TgRACK1)基因,原核表达、纯化TgRACK1,并分析其抗原性。方法制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgRACK1基因全长编码序列(GenBank登录号:AY547291)的开放阅读框设计引物并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pGEX-6p-1载体,重组质粒转化大肠埃希菌DH5α,阳性菌落经菌液PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定。将重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1转化至大肠埃希菌BL21(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗GST标签抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,免疫印迹(Western blotting)分析鉴定重组蛋白及其抗原性。重组融合蛋白经GST琼脂糖凝胶亲和纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度。结果 RT-PCR扩增产物约为970 bp,重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1构建成功。经IPTG诱导获得相对分子质量约63 kDa的可溶性重组蛋白。诱导表达的蛋白质为带GST标签的重组融合蛋白,且能被兔抗弓形虫血清识别。亲和纯化后获得纯度大于95%的重组TgRACK1蛋白质。结论克隆得到弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白质,且该重组蛋白具有抗原性。
- 王海龙殷丽天孟晓丽张铁娥关丽刘红丽殷国荣
- 关键词：刚地弓形虫原核表达抗原性
- 重组弓形虫肌动蛋白解聚因子滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答及保护作用被引量：1
- 2014年
- 目的观察重组弓形虫肌动蛋白解聚因子(Recombinant Toxoplasma gondii actin depolymerizing factor,rTgADF)滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答及抗弓形虫攻击的保护作用。方法 40只雌性BALB/c小鼠随机分为2组,分别用30μg rTgADF(溶于20μl PBS)和20μl PBS于第0、14和21d各滴鼻免疫1次。末次免疫后14d,每组处死小鼠5只,ELISA法测定血清IgA、IgG和IgG1/IgG2a及鼻咽、阴道和小肠冲洗液sIgA以及脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平。每组另取5只小鼠,用4×104 RH株弓形虫速殖子/只灌胃攻击(致死性),观察小鼠健康状况并计算存活率。其余小鼠用1×104速殖子/只灌胃攻击(慢性),攻击后30d处死,计数肝、脑组织速殖子。结果 rTgADF诱发小鼠产生较强的系统免疫和黏膜免疫应答,免疫组小鼠血清IgG、IgA和IgG1/IgG2a水平与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),鼻咽、阴道和小肠冲洗液sIgA水平与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),脾淋巴细胞培养液上清中IFN-γ和IL-2、IL-4水平与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),IL-10水平组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。致死性攻击后30d,对照组小鼠全部死亡,免疫组小鼠存活率为20%,差异有统计学意义(P<0.01);慢性感染后30d,免疫组小鼠肝和脑虫荷分别比对照组减少63.87%(P<0.01)和50.14%(P<0.05)。结论 rTgADF滴鼻免疫小鼠诱导产生较强的黏膜及系统免疫应答,并可部分抵抗弓形虫致死性和慢性攻击,可作为弓形虫候选蛋白疫苗。
- 关丽张铁娥王海龙孟晓丽杨建一殷国荣
- 关键词：刚地弓形虫肌动蛋白解聚因子黏膜免疫
