徐鹏卫
- 作品数：12 被引量：18H指数：2
- 供职机构：新乡医学院公共卫生学院更多>>
- 发文基金：艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- H1N1亚型流感病毒M1和NA基因在昆虫杆状病毒系统中的共表达
- 2015年
- 目的 构建共表达H1N1亚型流感病毒M1和NA基因的重组杆状病毒.方法 以PCR扩增H1N1亚型流感病毒A/PR/8/34毒株M1和NA基因,构建含有M1、NA双基因的重组转移载体pFBD-M1-NA,将其转化DH10Bac,获得重组Bacmid-M1-NA穿梭载体.将Bacmid-M1-NA转染sf9昆虫细胞,在细胞内包装出重组杆状病毒rBac-M1-NA,空斑实验测定病毒滴度,PCR方法鉴定外源基因插入情况.间接免疫荧光（IFA）检测M1、NA基因的表达情况.结果 获得的重组杆状病毒滴度为1×10^7pfu/ml;PCR检测结果证实M1、NA基因成功整合到了重组杆状病毒基因组.IFA结果显示,rBac-M1-NA感染的sf9昆虫细胞成功表达了M1、NA基因.结论 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功构建了共表达H1N1亚型流感病毒M1和NA基因的重组杆状病毒,为研究流感病毒样颗粒（VLPs）的形成机制以及新型流感疫苗研发奠定了基础.
- 陈爱珺姚立红徐鹏卫张智清郭建强
- 关键词：蛋白质类神经氨酸酶杆状病毒
- 共表达流感病毒基质蛋白1和基质蛋白2基因的重组杆状病毒的构建
- 2015年
- 目的构建共表达流感病毒基质蛋白1(matrix protein 1,M1)和基质蛋白2(M2)基因的重组杆状病毒。方法扩增流感病毒A/PR/8/34株的M1和M2全长基因,并将其分别插入到p Fast Bacdual(p FBD)载体的两个多克隆位点,筛选出阳性重组转座载体p FBD-M1/M2,将其转化含有穿梭载体Bacimd的感受态DH10Bac细胞,经同源重组获得重组穿梭载体r Bacmid-M1/M2,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,包装出重组杆状病毒r Bac-M1/M2。采用噬斑形成法检测重组病毒滴度,PCR法检测重组病毒基因组M1和M2基因插入情况,间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot法检测M1和M2基因的表达。结果经PCR鉴定重组穿梭载体r Bacmid-M1/M2构建正确;第3代r Bac-M1/M2滴度为1×108 pfu/ml;感染r Bac-M1/M2的sf9昆虫细胞经PCR扩增,可见3 600 bp的条带;可在感染细胞的胞内和胞膜上检测到明显的特异性黄绿色荧光;感染r Bac-M1/M2的细胞裂解上清与鼠抗流感病毒(PR8株)多克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约26 000及11 000处可见特异性反应条带。结论成功构建了共表达H1N1亚型流感病毒M1和M2基因的重组杆状病毒,为构建流感病毒样颗粒以及研制新型广谱流感疫苗奠定了基础。
- 姚立红陈爱珺徐鹏卫张智清郭建强
- 关键词：流感病毒杆状病毒
- H1N1亚型流感病毒NA基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及鉴定
- 2013年
- 目的构建含有H1N1亚型流感病毒NA基因的重组杆状病毒。方法用PCR方法扩增甲型H1N1亚型流感病毒（A／PR8／34）全长神经氨酸酶基因，并将其连接于pFastBacdual载体，构建杆状病毒转移载体pFBD-NA。转化含有Bacmld的DHl0B感受态细胞后，获得重组穿梭载体rBacmid—NA。将其转染昆虫细胞sf9，获得重组病毒rBac—NA。提取重组杆状病毒rBac—NA的DNA并使用PCR方法检测；采用间接免疫荧光，SDS-PAGE，WesternBlot鉴定以及ELISA方法检测所表达的NA蛋白。结果经PCR鉴定所构建质粒rBacmid—NA正确；使用间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光位于感染细胞的表面，WesternBolt检测可与小鼠抗PR8株多克隆抗体和兔抗甲型流感病毒NA多克隆抗体发生特异性免疫反应；经ELISA检测，NA蛋白可被鼠抗流感病毒（PR8）多克隆抗体特异性识别。结论上述结果证明，我们获得了表达流感病毒NA蛋白的重组杆状病毒，为进一步研究NA蛋白的功能和新型流感疫苗的开发奠定了基础。
- 姚立红付金奇陈爱珺刘晓宇徐鹏卫郭建强张乐翠
- 关键词：正黏病毒科神经氨酸酶
- 柯萨奇病毒A组19型VP1蛋白生物信息学分析
- 2024年
- 目的分析柯萨奇病毒A组19型(coxsackievirus A19,CVA-19)VP1蛋白的理化性质、结构功能并预测其线性B细胞表位和T细胞表位。方法应用ProtParam分析CVA-19 VP1蛋白的理化性质;ProtScale预测其亲疏水性;使用SignalP 6.0、DeepTMHMM、NetPhos-3.1和Motif Scan分别预测CVA-19 VP1蛋白的信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点和脂酰化位点;利用NetCGlyc-1.0、NetNGlyc-1.0和NetOGlyc-4.0分别预测CVA-19 VP1蛋白的C-甘露糖基化位点、N-糖基化位点和O-N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine,GalNAc)(粘蛋白型)糖基化位点;通过SOPMA和SWISS-MODEL在线工具分别预测CVA-19 VP1蛋白的二级结构和三级结构;使用网络服务器IEDB、Bepipred 3.0、ABCpred和SVTMrip联合预测其线性B细胞表位;应用IEDB和SYFPEITHI综合预测其T细胞表位。结果CVA-19 VP1蛋白的分子质量为33.099 ku,等电点为5.84,不稳定系数为37.50,总平均亲水性为-0.185,是一种稳定的亲水性蛋白,无信号肽、跨膜区和脂酰化位点。预测该蛋白含有30个可能的磷酸化位点、1个N-糖基化位点和7个O-GalNAc(粘蛋白型)糖基化位点,但无C-甘露糖基化位点。CVA-19 VP1蛋白的二级结构中,α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占24.66%、24.32%、2.70%和48.31%,以无规则卷曲为主。预测出该蛋白有6个潜在优势线性B细胞表位、3个潜在优势细胞毒性T淋巴细胞表位和9个潜在优势辅助性T细胞表位。结论用生物信息学方法预测CVA-19 VP1蛋白为稳定的亲水性蛋白,含有多个潜在的优势线性B细胞表位和T细胞表位,为进一步鉴定其线性表位奠定了基础,有助于CVA-19的抗体制备和疫苗研发。
- 杨亚文冯琳琳陶玲徐银兰徐鹏卫晋乐飞吴卫东
- 关键词：VP1蛋白抗原表位生物信息学
- H5N1亚型流感病毒M2与NA基因真核表达载体的构建与鉴定
- 2011年
- 目的 构建表达H5N1亚型流感病毒M2和NA基因的多种真核表达载体.方法 以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒（A/Anhui/1/2005）作为研究对象,PCR扩增全长M2与NA基因.将M2基因克隆入真核表达载体pStar的IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-M2/和pStar-/M2.将NA基因克隆人pStar载体IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-NA/和pStar-/NA.将M2和NA基因先后克隆到pStar载体IRES序列的上游和下游MCS,分别构建双基因共表达重组pStar-M2/NA和pStar-NA/M2.将重组质粒转染293细胞,使用IFA方法 检测各重组质粒相应外源基因的表达.结果 通过酶切鉴定,各重组质粒构建正确.将其转染293细胞后,使用IFA方法 检测到了各重组质粒中相应外源基因的表达.结论 构建了多种表达H5NI亚型流感病毒M2和（或）NA基因的真核表达载体,为研究开发流感DNA疫苗奠定了基础.
- 郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清
- 关键词：流感病毒A型病毒蛋白质类神经氨酸酶
- 流行性感冒防控新策略研究进展被引量：5
- 2017年
- 流行性感冒是由流行性感冒病毒引起的可造成大规模流行的急性呼吸道传染病,具有较高的发病率和致死率,是长期以来威胁人类健康的主要传染病之一。当前的疫苗、抗病毒药物可用于控制流行性感冒,但均存在一定的局限性和弊端,如流行性感冒疫苗的保护能力有限,且每年均需随病毒的变异而更新;抗病毒药物可能导致快速而广泛的耐药性产生。因此,研究更为安全、高效的流行性感冒防控手段仍是当前的科研热点之一,本文针对以病毒或宿主细胞为靶点的抗流行性感冒新策略进行了综述。
- 徐鹏卫代克强卢建国吴卫东
- 关键词：流行性感冒病毒疫苗抗病毒药物防控策略
- 共表达甲型流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒的构建被引量：2
- 2012年
- 为构建同时表达流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒,采用PCR扩增流感病毒A/PR/8/34株的M1基因和去除信号肽的HA基因,将两基因克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Dual的两个启动子下游的多克隆位点,筛选出阳性重组转座载体pFastBac Dual-M1-HA。将其转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,通过抗生素、蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-M1-HA,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1-HA。提取重组病毒基因组,通过PCR鉴定外源基因插入成功。间接免疫荧光和Western-blot检测表明,该重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中成功地表达了M1和HA。应用杆状病毒/昆虫细胞系统成功共表达流感病毒M1和HA抗原,为研究流感病毒VLP的形成机制和开发新型流感疫苗奠定了基础。
- 徐鹏卫郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇曾宪垠张智清
- 关键词：流感病毒血凝素共表达杆状病毒表达系统
- H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒的构建及鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的构建H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,并进行鉴定。方法 PCR扩增H1N1亚型流感病毒(A/PR/8/34)全长M1基因,与pFastBacdua(lpFBD)载体连接,构建重组杆状病毒转移载体pFBD-M1,转化含有Bacimd和Helper质粒的DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-M1,将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测M1基因的插入,间接免疫荧光、Western blot和ELISA法检测M1蛋白的表达。结果重组杆状病毒骨架质粒rBacmid-M1经PCR鉴定证实构建正确;第3代rBac-M1病毒滴度为3×108pfu/ml;感染rBac-M1的sf9细胞经PCR扩增可见3 300 bp的条带,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可与鼠抗流感病毒(PR8)和鼠抗M1蛋白(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,ELISA检测M1蛋白可与鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。结论已成功构建了H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,为进一步研究流感病毒M1的功能及新型流感疫苗开发奠定了基础。
- 郭建强付金奇姚立红陈爱珺徐鹏卫殷继永张智清
- 关键词：流感病毒杆状病毒SF9细胞基因表达
- 人H5N1流感病毒M1基因的亚克隆及其在原核细胞的表达被引量：1
- 2011年
- 目的 构建人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005 M1蛋白的原核表达系统，为进一步研究M1蛋白的生物学功能和制备其诊断试剂奠定基础。方法 以该病毒基因节段七cDNA为模板，PCR扩增得到M1基因片段。将该片段亚克隆至载体pQE80-L中，构建重组质粒pQE80-L/M1，转化大肠埃希菌BL21（ DE3）。IPTG诱导重组蛋白表达。金属镍离子螯合层析纯化N末端携带多聚组氨酸标签的重组M1蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体。结果 获得了重组M1蛋白，能与抗H5N1亚型流感病毒血清发生特异性结合，且其免疫后能诱导机体产生特异性抗体。结论 成功获得了人H5N1亚型禽流感病毒M1蛋白在原核细胞中高效表达。
- 陈爱珺郭建强姚立红程从升刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清
- 关键词：流感病毒A型基因基因表达
- 稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立被引量：2
- 2011年
- 目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。
- 郭建强陈爱珺姚立红刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清
- 关键词：哺乳动物细胞
