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GST-G3BP Domain 1～5原核表达质粒的构建及其表达被引量：1: 2008年; 目的:构建GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒,并在大肠杆菌中稳定表达。方法:PCR扩增G3BP Domain1～5片段,利用限制性内切酶EcoRI和NotI将其连接至载体pGEX-4T-1,将连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序。将转化正确的大肠杆菌过夜培养,IPTG诱导融合蛋白表达,immobilized Glutathione beads钓取目的蛋白。结果:G3BP Domain1～5片段均成功连接至载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21中可得到稳定表达的融合蛋白。结论:GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒构建成功。; 葛林何津岩邵洁东莉洁方建飞李晓东杨洁; 关键词：G3BP 质粒构建 DOWN

重组pEGFP—hSnu 114质粒的构建及表达: 2009年; 目的将hSnu114基因定向连人pEGFP质粒GFP的下游，使hSnu114蛋白可与绿色荧光蛋白在真核细胞内融合表达。从而为进一步研究hSnu114蛋白的功能奠定实验基础。方法本实验已经构建tr1E57R／T—hSnu114和pcDNA3．1（-）-hSnu114重组质粒，想要构建pEGFP—hSnu114重组质粒，需通过引入SalⅠ酶切位点，调整N端起始密码子与绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）基因之间的序列，使其不破坏读码框，融合蛋白正确表达。PCR扩增出hSnu114的第一部份（SalⅠ～MunⅠ基因序列），从hSnu114-peDNA3．1（-）重组质粒回收hSnu114的第二部分（MunI～BamHI片段），定向克隆至T／A载体，构建hSnu114全长（SalI～BamHI）pTZ57R／T重组质粒。采用SalI和BamHI双酶切方法，从重组质粒中获得hSnu114全长，将该基因片段连接入pEGFP质粒。将构建成功的pEGFP—hSnu114质粒，转染人HeLa细胞，荧光显微镜下可观察绿色荧光蛋白表达。进行Western印迹检测。结果①hSnu114Sal1～MunI目的片段获取。②将该pEGFP—hSnu114质粒进行双酶切鉴定可见hSnu114全长片段。③转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。④Western印迹可检测到pEGFP—hSnu114融合蛋白：结论①hSnu114全长成功载入pEGFP质粒。②hSnu114蛋白可与绿色荧光蛋白在真核细胞中融合表达。; 李晓冬方建飞东莉洁葛林何津岩杨洁; 关键词：重组质粒融合蛋白

重组质粒pEGFP—C1-STAT6的构建及在HeLa细胞中表达: 2009年; 目的构建以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）为报告基因的重组质粒pEGFP—C1-STAT6．观察其在HeLa细胞中的表达。方法以重组质粒pCLNEO—STAT6为模板，PCR法扩增出目的基因，将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP—C1上，构建重组质粒pEGFP—C1-STAT6，脂质体法转染HeLa细胞，western印迹检测融合蛋白的表达，并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位和分布。结果成功构建质粒pEGFP—C1—STAT6，并在HeLa细胞中实现表达；Western印迹检测到融合蛋白EGFP—STAT6；在荧光显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位。结论重组质粒pEGFP—C1-STAT6构建成功，可用于标记STAT6蛋白，为进一步研究STAT6在信号转导中的作用机制奠定基础。; 方建飞李晓冬何津岩葛林杨洁; 关键词：增强型绿色荧光蛋白 STAT6 重组质粒

转录共激活因子p100蛋白对转录因子STAT1和STAT6基因转录活性的调控作用: 研究目的：细胞内信号转导的转录响应的基本机制就是信号转导途径最终激活转录因子，并使相应的基因表达和造成细胞行为的改变。JAK/STAT信号转导途径是胞内重要的信号通路之一，其在细胞生成、分化、凋亡等生物学方面有重要的意义...; 方建飞; 关键词：转录激活因子免疫共沉淀虫荧光素酶转录调控; 文献传递

人类P100蛋白表达抑制稳定株的建立及其对HeLa细胞周期的影响被引量：2: 2008年; 目的构建针对人类P100(hP100)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒,转染后筛选P100表达抑制的稳定细胞株并鉴定其表达情况;同时检测其对细胞周期的影响。方法设计针对hP100基因的siRNA序列,构建pGenesil-shRNA-hP100质粒(smallhairpinRNA,shRNA,小发夹RNA),经测序鉴定后转染入宫颈癌细胞HeLa;经G418筛选出稳定株;Western印迹检测稳定株之抑制率。流式细胞术检测hP100蛋白表达抑制对细胞周期的影响。结果成功构建了针对hP100的siRNA质粒,并用之筛选出hP100蛋白表达抑制的稳定株,瞬时转染及稳定株hP100表达明显降低。流式细胞术显示抑制hP100蛋白表达使G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例降低。结论RNAi(RNA interference,RNA干扰)可持续稳定地抑制人类P100蛋白的表达,人类P100蛋白表达抑制对细胞周期有调节作用。; 何津岩葛林邵洁赵钢东莉洁方建飞姚智杨洁; 关键词：RNA干扰细胞周期

pEGFP-CI-G3BP转染Hela细胞及其在细胞中的表达被引量：1: 2008年; 目的:了解G3BP蛋白在细胞中的表达及定位。方法:利用脂质体lipofectamine2000将提取的质粒pEGFP-CI-G3BP转染进入Hela细胞,培养24h后荧光倒置显微镜观察绿色荧光的表达情况及其在细胞中的定位。结果:pEGFP-CI-G3BP质粒被成功转入Hela细胞内,转染后绿色荧光可高效表达,分布在细胞胞浆中。结论:脂质体法是一种高效的转染pEGFP-CI-G3BP的方法,表达的G3BP蛋白定位于细胞的胞浆部分。; 葛林步天栩何津岩邵洁东莉洁方建飞李晓冬孙晓明杨洁; 关键词：HELA细胞脂质体载体蛋白质类转染

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方建飞

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