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鸡α干扰素基因的克隆与表达被引量：5: 2008年; 通过对鸡α干扰素基因的克隆,获取一定纯度的干扰素蛋白。从NCBI上搜索出鸡α干扰素基因的序列,根据其成熟蛋白编码序列设计引物,通过PCR从家鸡肝脏基因组中扩增出成熟鸡α干扰素的编码基因,利用基因重组技术构建出pUCm-T/IFN-α,再亚克隆至载体质粒pET-43.1a(+),构建出pET-43.1a(+)/IFN-α重组质粒,经酶切鉴定、DNA测序,证明重组质粒构建正确。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵,IPTG诱导表达后进行纯化及SDS-PAGE分析。工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子量约19kDa的位置出现明显目的条带,约占菌体总蛋白的30%,表达产物主要以包涵体形式存在,经过NI2+-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳后经凝胶扫描纯度达95%以上。获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对鸡α干扰素进行复性及活性研究奠定了基础。; 焦道忠王云龙李晨阳李春利; 关键词：PCR扩增纯化

His标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用被引量：7: 2008年; 目的:制备和鉴定抗His标签单克隆抗体(mAb),初步建立检测和纯化带His标签融合蛋白的方法。方法:用碳化二亚胺法合成His-tag完全抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,通过有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定。结果:His-tag完全抗原偶联成功,经细胞融合、筛选及克隆化,成功获得1株分泌His标签mAb的杂交瘤细胞株。制备腹水测得腹水效价高于1∶106,且此株mAb与其他融合蛋白标签无交叉反应,并在含His标签融合蛋白的鉴定实验中取得了满意效果。结论:成功制备了1株His标签mAb,为带His标签融合蛋白的研究应用提供了重要的工具。; 王文礼王云龙李晨阳陈小科刘利锋; 关键词：单克隆抗体蛋白印迹

猪β干扰素成熟蛋白编码基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达与纯化被引量：1: 2006年; 从猪肝脏中提取基因组DNA,利用PCR法直接扩增了猪β干扰素成熟蛋白编码基因。将PCR产物亚克隆至pGEM-7Zf(+)载体,转化入大肠埃希菌TG1,筛选出阳性菌株后进行测序。序列分析结果表明,克隆片段含编码猪β干扰素成熟蛋白质的495个核苷酸,与GenBank上(登录号:S41178)的序列同源性达到100%。在此基础上,构建了猪β干扰素原核表达载体pQE30/poIFN-β并转化入大肠埃希菌M15。该工程菌在37℃经0.03mmol/LIPTG诱导4h后,进行SDS-PAGE电泳,结果在分子质量约20ku的位置出现了明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在。经凝胶分析软件Bandscan分析,表达产物约占菌体总蛋白的18%。包涵体用6mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪β干扰素进行复性及活性研究打下了基础。; 吴阳李玲玲李玉林李晨阳王岁楼; 关键词：基因克隆原核表达

猪瘟病毒E2蛋白A3BCD主要抗原结构域的原核表达被引量：3: 2009年; 目的:对猪瘟病毒E2蛋白A3BCD进行原核表达,以期获得具有抗原活性的表达产物。方法:利用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)技术从河南省近期流行猪瘟病毒野毒株中扩增得到E2基因,并将其克隆至pUCm-T载体,构建克隆载体pUCm-TE2;利用PCR方法扩增E2基因的主要抗原域A3BCD,克隆至pET-32a(+)载体,构建表达载体pET-32aE2-2,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,对诱导产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约35000处出现预期条带,表达产物主要以包涵体形式存在;Western-blotting检测表明,表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带;用8mol/L尿素(pH8.0)溶解包涵体,经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得纯度较高的目的蛋白,ELISA检测表明能与猪瘟抗体阳性血清发生特异性反应。结论:重组质粒pET-32aE2-2转化大肠杆菌Rosetta(DE3),解除了由于稀有密码子造成的表达限制,表达量得到提高;表达产物为硫氧还蛋白和E2-2的融合蛋白,易于纯化,且具有活性,为研制猪瘟抗体ELISA检测试剂盒奠定了基础。; 李春利王云龙李晨阳李玉林田璐王真吴阳; 关键词：猪瘟病毒 E2蛋白原核表达包涵体

猪血清白蛋白基因的克隆与序列分析被引量：2: 2007年; 血清白蛋白融合技术是一种开发长效重组蛋白药物的新技术。为了获得猪血清白蛋白(PSA)基因,根据GenBank(登录号:AY663543)中PSA的基因序列,设计一对引物,采用RT-PCR从新鲜猪肝组织中扩增出PSA基因的全长cDNA,产物纯化后连接至pBS-T载体,转化大肠埃希菌TG1,采用PCR法及酶切鉴定法筛选出阳性菌株后进行测序。序列分析结果表明,成功克隆了PSA基因的1 821 bp全长cDNA,与GenBank中参照基因序列同源性为99.6%,氨基酸序列同源性为99.5%。本研究数据已提交至GenBank,并申请到一个登录号EF202601。; 吴阳李晨阳李玲玲焦道忠李春利张宁宁王岁楼; 关键词：融合技术

猪γ干扰素基因的合成、表达及纯化被引量：5: 2007年; 目的通过人工合成猪γ干扰素(poIFN-γ)基因的编码序列,提高目的蛋白的表达。方法根据poIFN-γ的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏爱的密码子,设计并合成了24个寡核苷酸片段。通过重叠区扩增法,利用PCR合成poIFN-的成熟蛋白编码基因,克隆入pGEM-7Zf(+)载体,转化大肠杆菌TG1。经测序证实后,构建原核表达载体pBV222/poIFN-γ并转化大肠杆菌DH5α,经诱导表达后,进行SDS-PAGE分析及纯化。结果酶切及测序结果表明表达载体构建成功,工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子质量约16500的位置出现明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的55%,占包涵体中总蛋白的80%,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,纯度达90%以上。结论已获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪γ干扰素进行复性及活性研究奠定了基础。; 王云龙李玲玲李晨阳吴阳; 关键词：猪Γ干扰素基因合成纯化

乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白C端片段的克隆及原核表达被引量：3: 2008年; [目的]为进一步研制检测乙脑抗体试剂盒奠定了基础。[方法]以本实验室已构建的重组质粒pET-E(E为乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白)为模板,利用PCR扩增乙型脑炎病毒E蛋白基因3′端部分片段,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析表达产物。[结果]所表达的融合蛋白分子量约为38KD,表达产物以水溶形式存在,37℃,诱导4 h的诱导培养条件最佳,表达量约占茵体总蛋白的20?。表达产物经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。ELISA检测表明,表达的蛋白能与猪乙脑病毒抗体血清发生特异性反应,具有很好的抗原性。[结论]基因工程表达的JEV E蛋白有望成为重要的实验室诊断抗原。; 李春利王云龙李晨阳李玉林田璐赵瑞红李玲玲; 关键词：乙型脑炎病毒 E蛋白克隆

一种改进大肠杆菌DH5α转化效率的方法被引量：3: 2009年; [目的]提高大肠杆菌DH5α转化效率。[方法]在其他条件一致的情况下,将5μl的质粒或连接产物加入含有100μl的感受态0.2 ml PCR管和1.5 ml的离心管中,0.2 ml PCR管设置热休克时间梯度和1.5 ml的离心管热休克时间90 s,对大肠杆菌DH5α转化效率进行了比较。[结果]0.2 ml PCR管转化效率高于1.5 ml的离心管,且0.2 ml PCR管热休克30 s时最高。[结论]采用此方法提高了大肠杆菌DH5α的转化效率。; 杜红旗李晨阳田璐; 关键词：感受态 CACL2 热休克

猪γ干扰素基因的合成、表达及纯化被引量：2: 2008年; 目的通过人工合成猪γ干扰素(poIFN-γ)基因的编码序列,提高目的蛋白的表达。方法根据poIFN-γ的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏爱的密码子,设计并合成了24个寡核苷酸片段。通过重叠区扩增法,利用PCR合成poIFN-γ的成熟蛋白编码基因,克隆入pGEM-7Zf(+)载体,转化大肠杆菌TG1。经测序证实后,构建原核表达载体pBV222/poIFN-γ并转化大肠杆菌DH5α,经诱导表达后,进行SDS-PAGE分析及纯化。结果酶切及测序结果表明表达载体构建成功,工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子质量约16500的位置出现明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的55%,占包涵体中总蛋白的80%,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,纯度达90%以上。结论已获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪γ干扰素进行复性及活性研究奠定了基础。; 王云龙李玲玲李晨阳吴阳; 关键词：猪Γ干扰素基因合成

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李晨阳

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