罗英英
- 作品数：6 被引量：8H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院感染性疾病分子生物学教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金重庆市教育委员会科学技术研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 通过自诱导方法对乙型肝炎病毒聚合酶TP区进行可溶性表达及鉴定被引量：5
- 2017年
- 目的构建包含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)聚合酶TP区段的重组原核表达质粒,转化表达型大肠埃希菌,以自诱导培养方法获得可溶性表达,并对其进行鉴定。方法分析HBV(A型)聚合酶N-末端1-192 AA区域的DNA序列,通过网络工具(http://www.jcat.de/)在线优化,并在5′和3′端分别添加NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点后,送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行人工合成;将人工合成的TP-DNA双酶切后,插入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS进行自诱导表达。结果重组原核表达质粒pET32a(+)/POL-TP-Opt经双酶切及测序证明构建正确;在表达菌的破菌上清中有特异性表达的蛋白,相对分子质量约20 000,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,为可溶性的重组TP蛋白。结论通过自诱导培养方法,直接成功获得可溶性的重组TP蛋白,改变了长期以来依靠包涵体复性对TP蛋白相关功能进行研究的状况。
- 陈可代娟甘春扬刘亚罗英英胡接力蔡雪飞
- 关键词：乙型肝炎病毒聚合酶原核细胞基因表达
- 乙肝病毒核心蛋白钉突部位基因工程改造对其功能的影响
- 2013年
- 通过在乙肝病毒核心蛋白钉突部位插入标签蛋白EGFP及小片段多肽,研究各种改造对HBc功能的影响。采用RLIC方法,构建野生型HBc、HBc钉突部位带不同接头的EGFP融合重组体、缩短的EGFP融合重组体,并构建与HBc功能互补的质粒HBV1.1c-,将不同重组体与HBV1.1c-共转染HEK293细胞,通过观察荧光及Southern blotting检测病毒复制中间体,判断相应基因工程改造对重组蛋白中不同结构域功能的影响。RLIC方法可有效地用来进行片段缺失,且缺失片段大小及位置无明显限制。带柔性或刚性接头的重组HBc-EGFP均可产生绿色荧光,但荧光在细胞内分布形态不同,两种重组HBc-EGFP均不能支持正常的HBV复制,各种截短的插入片段以及aa79-80单独缺失体亦不能支持HBV复制。结果表明RLIC方法是一种基因工程改造的有力工具,不同类型接头对重组蛋白的结构和功能有不同影响,aa79-80对维持HBc的主要功能之一——支持HBV复制有重要作用。
- 陈江燕黄荣陶颖黄媛罗英英黄爱龙胡接力
- 关键词：乙型肝炎病毒核心蛋白绿色荧光蛋白基因工程
- 乙型肝炎病毒不同基因型DNA聚合酶对病毒复制水平的影响被引量：1
- 2014年
- 目的:研究不同基因型聚合酶(polymerase,pol)复制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA的能力是否存在差异。方法:采用不依赖酶切和连接的克隆(restriction digestion and ligation-independent cloning,RLIC)方法和HBV聚合酶反式互补技术表达并检测A、B、C、D 4种基因型聚合酶复制HBV DNA的情况。结果:(1)反式互补技术可使A、B、C、D型HBV重新获得表达,HBV DNA量分别为A=(63.03±8.03)×105 copies/μl,B=(23.23±3.53)×105 copies/μl,C=(17.63±1.25)×105 copies/μl,D=(75.73±9.43)×105 copies/μl。(2)HBV不同基因型聚合酶之间复制HBV能力存在差异,F(4,10)=91.88,P=0.000。(3)A型和D型聚合酶复制HBV能力强于B型和C型聚合酶,差异有统计学意义,P(A,B)=0.001,P(A,C)=0.001,P(B,D)=0.001,P(C,D)=0.001。结论:HBV不同基因型聚合酶之间复制HBV能力存在差异;为深入研究不同基因型在地理分布、所致疾病严重性等方面提供了有用信息并奠定了坚实的基础。
- 罗英英胡接力陈江燕黄荣黄爱龙
- 关键词：基因型聚合酶乙型肝炎病毒DNA
- CRISPR/Cas9基因剪辑技术在乙型肝炎病毒感染治疗中的应用
- 2017年
- CRISPR/Cas9基因剪辑技术源于细菌及古细菌CRISPR介导的后天获得性免疫系统,通过引导RNA与靶DNA PAM序列特异性识别,引发Cas9核酸酶定点切割互补双链DNA,在基因剪辑方面具有制备简单、剪辑位点特异性高及易于同时剪辑多个基因位点等优势,已被广泛应用于哺乳动物细胞基因剪辑。本文主要从CRISPR/Cas9技术作用原理和其抗乙型肝炎病毒感染作用及机制等方面进行综述。
- 罗英英黄爱龙胡接力
- 关键词：CRISPR乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA
- 一种适用于片段替换/插入突变扫描的克隆方法
- 2016年
- 功能序列的改造是基因工程的一项基础技术。序列改造往往涉及较大片段的插入或替换,为了获得更优化的改造序列,这种片段插入或替换经常需要以扫描方式进行。传统的酶切连接方式在这种情况下可能难以实现或者费时费力。建立了一种golden gate方法结合混合克隆和快速鉴定的策略(简称Gmix),利用该策略,成功地将外源基因(Gaussia荧光素酶基因)以4种模式,扫描式插入或替换HBV复制质粒的指定区域。该方法成功率高,操作简便快速且成本较低,适合于其他DNA序列的类似改造工作。
- 甘春杨刘亚罗英英张文露黄爱龙蔡雪飞胡接力
- 关键词：克隆基因工程GOLDENGATE
- 体外培养细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立被引量：2
- 2013年
- 目的:建立一种体外培养细胞内乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的检测方法。方法:Southern blot检测HBV复制中间体,以确认HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞是否支持HBV复制;用Hirt法分别提取细胞内的去蛋白DNA(protein-free DNA,PF DNA),经加热变性处理,EcoRⅠ酶切,然后用Southern blot检测HBV cccDNA;用同样方法检测不同培养时间的HepAD38细胞内cccDNA,观察培养时间对cccDNA积累量的影响。结果:用Southern blot可在HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞中检测到HBV复制中间体;Hirt法提取物经变性和酶切处理,可有效地将cccDNA与其他形式HBV DNA区分开;HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞内均可检测到HBV cccDNA;HepAD38细胞在铺满后继续培养的时间较长时,其细胞内cccDNA的量较多。结论:成功建立了体外培养细胞内HBV cccDNA检测方法,该方法结合Hirt提取法和地高辛探针Southern blot方法,能可靠、准确地检测HBV cccDNA。
- 黄荣陈江燕胡接力罗英英黄爱龙
- 关键词：乙型肝炎病毒共价闭合环状DNASOUTHERNBLOT
