于文
- 作品数：11 被引量：30H指数：3
- 供职机构：南华大学医学院病原生物学研究所更多>>
- 发文基金：湖南省自然科学基金湖南省教育厅优秀青年基金湖南省教育厅科研基金更多>>
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- 幽门螺杆菌ureI核酸疫苗免疫活性的初步研究
- 2013年
- 目的观察幽门螺杆菌ureI核酸疫苗诱导C57BL/6小鼠产生体液免疫应答及细胞免疫应答水平。方法重组质粒pcDNA3.1(+)/ureI、空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分别肌注免疫C57BL/6小鼠。ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平以及脾淋巴细胞培养上清中IL-4和IFN-γ含量,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,PCR和免疫荧光组化法检测ureI基因和蛋白表达。结果 pcDNA3.1(+)/ureI能够诱导小鼠产生特异性IgG抗体,该组小鼠脾淋巴细胞经UreI重组蛋白刺激后,其刺激指数和培养上清中IL-4、IFN-γ含量明显升高;ureI基因可在小鼠肌细胞中有效表达。结论 pcDNA3.1(+)/ureI核酸疫苗能刺激C57BL/6小鼠产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,为进一步研究该疫苗的免疫保护作用奠定了基础。
- 李杰于文刘胜张艳朱翠明吴移谋
- 关键词：幽门螺杆菌核酸疫苗免疫活性
- 幽门螺杆菌VacA N端真核表达载体的构建、鉴定及其诱导巨噬细胞空泡化和凋亡的观察被引量：2
- 2008年
- 目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)空泡毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)基因的真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/vacA,并在THP-1巨噬细胞中表达,为研究VacA单一毒力决定簇的致病性奠定实验基础。方法用Primer 5.0软件设计引物,以HP基因组为模板,PCR扩增vacA目的基因片段,克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR鉴定及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,荧光显微镜和Western-blot检测VacA蛋白在细胞中的表达;电镜观察巨噬细胞(MΦ)的空泡样变和凋亡;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果PCR扩增得到了大小约为1 428bp的目的片段,双酶切及测序鉴定证明成功构建了HP真核表达重组载体;转染后24h,重组质粒组部分细胞中有聚集的荧光颗粒,部分细胞发生空泡样变和凋亡改变;细胞凋亡率明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.001),细胞核因子-κB(nuclear factorkappaB,NF-κB)的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制细胞的凋亡。结论VacA蛋白瞬时高表达促进THP-1巨噬细胞空泡样变和凋亡。NF-κB可能参与调节VacA诱导的巨噬细胞凋亡。
- 黎村艳张艳刘志杰余敏君于文
- 关键词：幽门螺杆菌空泡毒素巨噬细胞凋亡
- 幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI的研究进展
- 2008年
- 幽门螺杆菌（Hp）是世界各地最常见的感染性病原之一，能够在胃酸条件下生长和繁殖，是胃炎、消化道溃疡的重要致病因素，与胃癌的发生密切相关。最近研究表明，Hp酸适应性机制在于细菌内膜上存在尿素通道蛋白（UreI）。国内外对该蛋白的作用和酸适应性机制作了深入研究，结果表明UreI与Hp酸适应性密切相关。此文对尿素酶的基因结构、通道蛋白UreI的作用及其作用机制等进行了综述。
- 于文张艳
- 关键词：幽门螺杆菌消化道溃疡
- 幽门螺杆菌Lpp20重组蛋白的表达、纯化及其免疫活性初步研究被引量：1
- 2010年
- 目的表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)脂蛋白Lpp20基因的重组蛋白,并检测其免疫活性。方法应用PCR技术从H.pylori标准株26695染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段,将其克隆至表达载体pGEX-6P-2上,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21中表达并进行GST亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物重组Lpp20(recombinantLpp20,rLpp20)的免疫反应性。免疫C57BL/6小鼠后,以rLpp20为包被抗原建立间接ELISA法对免疫小鼠血清进行特异性抗体检测;ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4水平;MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应等指标以分析rLpp20的免疫活性。结果扩增的lpp20全长528 bp,与GenBank上公布的H.pylori 26695株lpp20序列作BLAST比较,结果完全一致;成功构建了pGEX-6P-2/Lpp20重组质粒,表达的rLpp20 M_r 43 000,纯化产物可被鼠抗H.pylori抗体识别;以rLpp20为包被抗原建立的间接ELISA法检测免疫小鼠血清,与对照组相比rLpp20免疫组可见阳性反应;rLpp20免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL-2和IL-4含量均明显升高;脾淋巴细胞增殖反应测定,rLpp20免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数也明显升高,与对照组有明显差异。结论rLpp20具有良好的免疫活性,在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答,为筛选高效的H.pylori疫苗抗原奠定了基础。
- 靖吉芳张艳刘志杰于文
- 关键词：幽门螺杆菌LPP20重组蛋白蛋白表达免疫活性
- 幽门螺杆菌Lpp20-IL2核酸疫苗免疫活性被引量：6
- 2010年
- 【目的】观察pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫C57BL/6小鼠后所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制高效、新型的幽门螺杆菌核酸疫苗提供实验依据。【方法】构建pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2重组载体,并转染HeLa细胞,用Western-blot观察鉴定其在真核细胞得到表达后免疫C57BL/6小鼠,ELISA间接法测定小鼠血清中抗Lpp20IgG抗体水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL4水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,免疫荧光组化法检测Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中的表达情况。【结果】成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2真核表达载体,且重组质粒能在HeLa细胞内有效表达目的蛋白;小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,8w后ELISA测定血清抗体A450值明显升高。核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL4含量明显升高。pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2和pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数明显高于空质粒组和PBS组。Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中能够有效表达。【结论】幽门螺杆菌Lpp20-IL2融合基因核酸疫苗和Lpp20单基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答和体液免疫应答,且前者能诱导更强的细胞免疫应答。
- 于文张艳靖吉芳刘志杰
- 关键词：幽门螺杆菌白细胞介素2核酸疫苗免疫活性
- 幽门螺杆菌ureI和lpp20乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的以幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI和外膜脂蛋白lpp20为目的基因,分别构建乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20,为H.pylori乳酸乳球菌活菌口服疫苗的研制奠定实验基础。方法根据幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI和脂蛋白Lpp20的全基因序列,利用PRIMER5.0各设计一对引物,进行PCR扩增,获得ureI和lpp20目的基因片段,将其与分泌表达载体pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体,并进行重组疫苗菌稳定性检测。结果以H.pylori标准株基因组DNA为模板分别扩增出特异的ureI和lpp20基因片段,大小分别为588 bp和528 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为588 bp和528 bp的H.pylori ureI和lpp20目的基因片段;并成功构建了幽门螺杆菌ureI及lpp20基因乳酸乳球菌表达重组载体。
- 于文靖吉芳张艳
- 关键词：幽门螺杆菌乳酸乳球菌口服疫苗
- 幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达被引量：1
- 2010年
- 目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。
- 李杰于文张艳靖吉芳
- 关键词：幽门螺杆菌
- 壳聚糖介导增强幽门螺杆菌Lpp20 DNA疫苗黏膜免疫效果的研究被引量：3
- 2011年
- 目的 探讨壳聚糖包裹DNA疫苗黏膜免疫效果.方法 采用复凝聚法制备载幽门螺杆菌脂蛋白 Lpp20基因的壳聚糖（CS）纳米粒（NPs）,并对CS/DNA纳米粒的特质进行研究 用载基因壳聚糖纳米粒黏膜免疫（滴鼻和口服）小鼠,检测免疫小鼠的细胞和体液免疫水平.结果 裸质粒pcDNA3.1（＋）/Lpp20与CS/DNA NPs通过黏膜免疫均能诱导小鼠产生有效的免疫应答.CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组诱导的抗体明显升高,与裸质粒组相比有明显差异（P＜0.05）,同时CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数及培养上清中IFN-γ和IL-4含量明显高于裸质粒组、壳聚糖组和PBS组,且滴鼻免疫组高于口服组.结论 壳聚糖纳米粒能增强pcDNA3.1（＋）/Lpp20核酸疫苗的黏膜免疫（滴鼻和口服免疫）效果 载Lpp20基因壳聚糖纳米粒滴鼻免疫比口服免疫能诱导更强的细胞和体液免疫应答.
- 曹斌张艳刘志杰于文余敏君
- 关键词：壳聚糖纳米粒幽门螺杆菌LPP20核酸疫苗
- 幽门螺杆菌VacA N端片段通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡被引量：11
- 2011年
- 目的:本研究初步探讨幽门螺杆菌(H.pylori)空泡毒素单一毒力决定簇对GES-1胃黏膜上皮细胞凋亡的影响,为进一步研究H.pylori的致病机制奠定基础。方法:将本课题组已构建的pDsRed-Monomer-C1/VacA N端真核表达载体转染至GES-1细胞中,Western blot鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄取试验检测GES-1细胞的空泡样变;Hoechst33342染色、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒以及电镜观察细胞凋亡情况,同时采用分光光度法检测细胞Caspase-9、Caspase-3的活化程度,Rho123检测细胞跨膜电位的变化,ELISA法检测细胞色素C的释放。结果:重组质粒pDsRed-Monomer-C1/VacA转染GES-1细胞24小时后,电镜下可明显观察到空泡样变及核固缩、染色质边聚等凋亡特征,重组质粒组部分细胞发生空泡样变;Hoechst 33342染色后镜下可见明显的核染色质浓缩,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测发现重组质粒组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);Caspase-9和Caspase-3活化程度呈时间依赖性增加,分别在12小时和24小时达到峰值;Rho123染色发现线粒体跨膜电位明显降低;重组质粒转染组释放细胞色素C的浓度呈时间依赖性正相关,与空质粒组及对照组相比差异显著(P<0.05)。结论:VacA N端片段可诱导GES-1细胞凋亡及空泡样变,VacA蛋白可激活Caspase-9和Caspase-3,且可能主要通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡。
- 杨卓张艳黎村艳于文曹斌余敏君
- 关键词：幽门螺杆菌VACAGES-1细胞线粒体途径细胞凋亡
- 幽门螺杆菌VacA通过激活NF-κB诱导巨噬细胞分泌及凋亡被引量：3
- 2009年
- 目的研究幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）空泡毒素（VacA）单一毒力决定簇对THP-1巨噬细胞分泌和凋亡的影响，以及核因子κB（nuclear factor κB，NF—κB）在调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞功能中的作用。方法将pDsRed—Monomer—C1／vacA转染THP-1巨噬细胞，ELISA法检测巨噬细胞培养上清IL-1β、TNF-α含量；Griess试剂分析培养上清的一氧化氮（NO）水平；荧光探针DCFH-DA检测培养上清的活性氧（ROS）；流式细胞仪检测细胞的凋亡率；凝胶阻滞试验（electrophoretic mobility gel shift assay，EMSA）检测NF—κB的核转位。结果重组质粒转染后6h，重组质粒组培养上清中TNF-α、IL-1β含量明显高于阴性对照组（P〈0．05）；且分别于转染后6h或24h到达峰值；转染后6h或12b，重组质粒组培养上清中NO、ROS含量明显高于阴性对照组（P〈0．05），且于转染后24h达到高峰。转染后16h，重组质粒组的凋亡率明显升高，与阴性对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。重组质粒组加NF—κB的特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）后，IL-1β、TNF-α、NO、ROS的分泌量和细胞的凋亡率明显降低，与重组质粒组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。EMSA试验显示，转染后3h细胞核内有活化的NF—κB，且于转染后12h活性最强。结论VacA蛋白瞬时高表达上调THP-1巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO和ROS；VacA蛋白瞬时高表达诱导THP-1巨噬细胞凋亡；NF—κB可能参与调节VacA诱导的THP-1巨噬细胞的分泌和凋亡。
- 黎村艳张艳余敏君刘志杰于文
- 关键词：幽门螺杆菌空泡毒素巨噬细胞凋亡NF-ΚB
