庞强
- 作品数：8 被引量：6H指数：1
- 供职机构：第二军医大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市科学技术委员会基础研究重点项目安徽省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建及在大肠杆菌中的高效表达
- 2009年
- 目的构建HIV-1HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行高效表达和纯化。方法应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸,22～37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(△C)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN)DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA进行鉴定。结果构建了pET32a-Tat(CN)突变体,pET32a-Tat(CN)融合蛋白在大肠杆菌中表达水平为5.17mg/ml,相对分子质量为31ku。间接的ELISA结果表明,pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应。结论成功构建了HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区移位至TatN端的突变体,并能在大肠杆菌中高效表达,其纯化的蛋白pET32a-Tat(CN)很好地保留了与HIV-1Tat兔抗血清的免疫反应性,为HIV-1Tat的疫苗基础研究提供了一有价值的研究结论。
- 李存枚潘卫曹洁王锦红黄德圣庞强廖文婷邓松华
- 关键词：TAT
- HIV-1 HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒的构建及表达被引量：1
- 2009年
- 目的构建HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Ta(tB41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础。方法在HIV-1HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tat1-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因ta(tB41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-ta(tB41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。融合蛋白经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Westernblot及ELISA鉴定。结果重叠延伸PCR扩增出约500bp的ta(tB41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-ta(tB41-101N)构建正确。SDS-PAGE分析显示,表达的Ta(tB41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36000,约占菌体总蛋白的7%,纯化后纯度约为60%;Westernblot和ELISA分析显示,Ta(tB41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应。结论已成功构建了HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础。
- 廖文婷陈璐曹洁陈秋莉王锦红唐萍庞强黄德胜潘卫
- 关键词：HIV-1TAT蛋白原核表达重叠延伸PCR
- 噬菌体展示HIV-1 Tat38-61碱性区51和55位随机突变体文库的构建被引量：4
- 2011年
- 为了构建噬菌体展示Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库,进一步研究HIV-1 Tat38-61表位的分子进化筛选,采用含随机核苷酸序列的引物,通过Overlap PCR的方法获得51和55位氨基酸随机突变的全长Tat编码序列,再以此为模板PCR扩增出两端含有Xba I识别序列的Tat38-61突变体片段HIV-1 Tat38-61(51N/55N),克隆至噬菌体展示载体pCANTAB5S上,转化大肠杆菌TG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建噬菌体展示Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体文库。结果显示文库的库容量为5.0×106,滴度为2.65×1012 TU/mL,阳性克隆率为56.50%;序列分析显示文库中51、55位核苷酸与氨基酸均呈随机性分布,达到了对文库进行分子进化筛选的要求,为获得可用作疫苗候选物的新型Tat突变体奠定基础。
- 葛宜兵杨旭芳杜哲明庞强曹洁陈秋莉王锦红张华群廖文婷祁培培刘超章萍萍邓松华潘卫
- 关键词：HIV-1TAT随机突变噬菌体展示
- HIV-1 HXB2株Tat核心碱性区多肽Tat_(38-61)的原核表达及其免疫反应性
- 2011年
- 目的 构建HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法采用PCR法从HIV-1 HXB2株Tat1-101基因中扩增编码Tat38-61的基因序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后,ELISA法鉴定其免疫反应性。结果重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量约21 300处可见目的 蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的67.4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达97%以上;ELISA结果显示,该融合蛋白与兔抗PEPTIDE-Tat1-101血清及HIV阳性血清均呈特异性反应。结论已成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61的重组原核表达质粒,表达并纯化了PET32a(+)-Tat38-61融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为Tat38-61噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。
- 庞强曹洁陈秋莉王锦红张华群黄德胜葛宜兵潘卫
- 关键词：重组融合蛋白质类原核细胞免疫反应性
- 构建SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库
- 2010年
- 目的构建免疫球蛋白结合分子金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)和链球菌蛋白G(SPG)单结构域随机组合噬菌体展示文库,为研究其分子功能与结构的关系奠定基础。方法 PCR扩增制备SPA的A、B、C、D、E结构域和SPG的B2结构域核苷酸片段,在片段两端通过引物引入XbaⅠ酶切位点和保护碱基,3'端引入3个氨基酸大小的随机连接肽核苷酸序列,各结构域核苷酸片段经XbaⅠ酶消化,在T4连接酶作用下随机相互连接并克隆于噬菌体展示载体pCANT-AB5S,克隆产物转化E.coliDH5α,提取原代库质粒转化E.coliTG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库。结果该噬菌体展示文库库容量为1.87×107cfu,滴度为1.3×1014TU/ml,文库的片段插入率近100%,其中插入多个结构域的阳性克隆占21.7%,序列分析显示各结构域之间的连接和随机连接肽序列具有随机性。结论成功地构建了SPA和SPG单结构域随机组合噬菌体展示文库,该文库在库容量、多样性和随机性方面满足体外分子进化研究的要求。
- 黄德圣潘卫曹洁庞强唐萍廖文婷李存枚陈秋莉邓松华
- HIV-1 Tat核心碱性区随机突变组合文库的构建及亲和筛选
- 人类免疫缺陷病毒/(Human immunodeficiency virus, HIV/)归属于逆转录病毒科中慢病毒属,主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播,可引起获得性免疫缺陷综合症/(Acquired Immune...
- 庞强
- 关键词：随机突变噬菌体展示
- 文献传递
- HIV-1 Tat疫苗基础研究进展
- 2010年
- 庞强廖文婷潘卫
- 关键词：HIV-1TAT蛋白疫苗
- 用兔IgG筛选噬菌体展示免疫球蛋白结合分子组合文库被引量：1
- 2009年
- 目的应用噬菌体展示免疫球蛋白(Ig)结合分子组合文库,进化筛选获得与兔IgG结合的代表性序列,测定其与兔IgG及人IgG结合活性的差异,以判断筛选获得的代表性序列对不同种属Ig的结合是否存在倾向性的差别。方法应用包含Ig效应子结合蛋白Protein A的D结构域(PA-D)、A结构域(PA-A),Protein G的B2结构域(PG-B2)及protein L的B3结构域(PL-B3)的单结构域随机组合文库,以兔IgG对该组合文库进行进化筛选,序列比较分析筛选获得的代表性序列与人IgG进化筛选文库所得代表性序列的异同性;用ELISA和竞争抑制试验分别测定阳性噬菌体克隆与兔IgG及人IgG的结合活性。结果以兔IgG经4轮分子进化筛选,获得在天然细菌蛋白中不存在的新的结构形式PA-A—PA-A,该结果与人IgG进化筛选所得代表性序列PA-A—PG有显著差异;兔IgG筛选序列PA-A—PA-A和人IgG筛选序列PA-A—PG分别显示出与兔Ig和人Ig结合力更强的特性。结论该研究首次应用噬菌体展示技术研究不同种属抗体效应子构象的不同,证实兔IgG和人IgG两者效应子构象之间确实存在差异。这一结论有助于阐明抗体效应子构象在不同种属之间的差异性。
- 唐萍潘卫曹洁廖文婷陈秋莉黄德圣庞强王锦红邓松华
- 关键词：免疫球蛋白类免疫球蛋白G
