李泽良
- 作品数：6 被引量：3H指数：1
- 供职机构：军事医学科学院放射与辐射医学研究所更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 腺病毒-甲病毒杂合载体的构建
- 2010年
- 目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下:利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子(CD11a promoter,CD11Ap)、甲病毒载体元件(nsP)、目的基因(GFP)、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数(100MOI)分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP+细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP+细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。
- 李泽良王华杨月峰肖凤君鲁茁壮王立生
- 关键词：腺病毒科甲病毒属复制子基因转移技术
- 腺病毒-甲病毒杂合载体的构建及病毒制备
- 基因转移载体有很多种，各有特色，其中腺病毒载体(Adenovector，Ad)由于感染细胞类型广、感染效率高、既能感染分裂期也能感染非分裂期细胞、不整合入细胞基因组（遗传毒性较低）、容易制备高滴度病毒、理化性质稳定等优点...
- 李泽良
- 关键词：腺病毒甲病毒肿瘤基因治疗基因转移
- 文献传递
- 靶向型辅助腺病毒的构建及其功能研究被引量：1
- 2014年
- 目的构建一种新型辅助腺病毒,并用于靶向型第三代腺病毒载体的制备,提高其对造血细胞的感染效率。方法采用重叠PCR的方法合成含有不完全包装信号序列A1-A4和loxP序列的DNA片段SynES,替换穿梭质粒pShuttle中原有的包装信号序列,得到穿梭质粒pShuttle-SynES;将所得穿梭质粒与骨架质粒Ad5/F11p在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得重组腺病毒质粒载体pAd5/F11p-HV,将其转染293细胞包装重组腺病毒Ad5/F11p-HV。参照第三代腺病毒包装策略,利用Ad5/F11p-HV包装获得携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;将其以不同的感染强度感染人白血病细胞系K562、U937、Jurkat和人脐带血CD34+细胞后,采用荧光显微镜和流式细胞术检测GFP的表达。结果采用DAN片段SynES替换穿梭质粒pShuttle上的包装信号,获得新的穿梭质粒pShuttle-SynES;进一步构建获得重组腺病毒质粒pAd5/F11p-HV,并制备了辅助腺病毒Ad5/F11p-HV。采用该辅助腺病毒包装pC4HSU-GFP,获得了第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;CsCl密度梯度离心分离HD-Ad5/F11p-GFP和Ad5/F11p-HV,获得了高质量的HD-Ad5/F11p-GFP。与对照病毒HD-H14-GFP相比,HD-Ad5/F11p-GFP可明显提高对人白血病细胞U937、Jurkat和人脐带来源CD34+细胞的感染效率。结论设计并构建了一种靶向性辅助腺病毒,并以此为基础成功制备了对造血细胞高效感染的第三代重组腺病毒。
- 杨月峰李泽良鲁茁壮王华肖凤君张群伟孙慧燕王立生
- 关键词：辅助病毒白血病
- 携带miR29c重组腺病毒的制备及其促骨髓瘤细胞凋亡作用被引量：2
- 2012年
- 目的制备携带miR29c的重组腺病毒Ad5F11p-miR29c,评价miR29c对骨髓瘤细胞凋亡的影响。方法巢式PCR扩增得到hsa-miR29c,将hsa-miR29c基因克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,得到pShuttle-CMV-miR29c。鉴定正确后,PmeI线性化并转化含Ad5F11p骨架质粒的BJ5183感受态细胞,重组获得腺病毒载体。PacI线性化的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞,制备重组腺病毒Ad5F11p-miR29c。以对照病毒Ad5F11p-EGFP感染人骨髓瘤细胞系SKO-007、U266和XG7,通过流式细胞术确定最佳感染复数。Ad5F11p-miR29c以最佳感染复数感染骨髓瘤细胞,流式细胞术检测miR29c对细胞凋亡的影响。结果 PCR扩增获得miR29c基因,成功将其连接到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,经测序鉴定正确。采用Ad-easy系统,成功构建并制备了CMV启动的重组腺病毒Ad5F11p-miR29c。流式细胞术结果显示,Ad5F11p-EGFP对SKO-007和U266细胞的最佳感染复数为150MOI;而XG7为100MOI。Ad5F11p-miR29c以最佳感染复数感染细胞48h后,细胞凋亡率升高。SKO-007细胞的凋亡率达到26.5%,XG7细胞的凋亡率达到46.9%。结论成功制备重组腺病毒Ad5F11p-miR29c,并证实miR29c能够诱导骨髓瘤细胞凋亡。
- 张怡堃王华杨萍李泽良杨月峰陈协群王立生
- 关键词：微RNAS腺病毒科骨髓瘤
- 腺病毒—甲病毒杂合载体的构建及病毒制备
- 基因转移载体有很多种,各有特色,其中腺病毒载体(Adenovector, Ad)由于感染细胞类型广、感染效率高、既能感染分裂期也能感染非分裂期细胞、不整合入细胞基因组(遗传毒性较低)、容易制备高滴度病毒、理化性质稳定等优...
- 李泽良
- 关键词：腺病毒甲病毒
- 一种高效感染造血细胞的第三代腺病毒-甲病毒杂合病毒载体
- ＜正＞目的:构建高效介导造血细胞基因转移的腺病毒-甲病毒杂合载体,明确其对造血细胞的感染效率并初步探讨其机制,为杂合载体应用于造血细胞介导的基因治疗,特别是白血病自体瘤苗体外修饰,提供实验依据和基础。方法:采用第三代重组...
- 杨月峰肖凤君王华鲁茁壮李泽良朱晓娜刘银霞李庆芳张群伟王立生
- 文献传递
